Conception guidée par structure de nouveaux dérivés de la l-cystéine en tant qu’inhibiteurs puissants du KSP

Antimitotique

des agents tels que des stabilisateurs de microtubules (par exemple, des taxanes) et des déstabilisateurs

(par exemple, vinca alcaloïdes) ont été cliniquement validés dans le traitement

de plusieurs cancers.1 Eribulin, qui est

dérivé du produit naturel haricondolyn B, a récemment été

approuvé comme inhibiteur des microtubules avec un nouveau mode d’action pour

le traitement du cancer du sein métastatique.2 Les microtubules jouent des rôles importants tout au long du cycle cellulaire du cancer

cellules; cependant, la perturbation de la dynamique des microtubules produit des effets indésirables

effets secondaires, tels que la neurotoxicité et la neuropathie périphérique,

sont liés au rôle central de la tubuline joue dans la signalisation cellulaire et

transport vésiculaire.3 Résistance acquise aux médicaments

est un autre obstacle qui peut survenir suite à l’utilisation à long terme de ces

agents.4 Pour surmonter ces limitations,

nouveaux agents anticancéreux qui n’agissent pas directement sur les microtubules sont

en cours de développement.5 protéine de fuseau de Kinesin

(KSP), connu sous le nom de Hs Eg5, un membre de la famille Kinesin-5, joue un

rôle important dans la formation et le maintien de la broche bipolaire.6 Inhibition de KSP conduit à l’arrêt du cycle cellulaire

au cours de la mitose et entraîne des cellules avec des fuseaux monopolaires (soi-disant

monoastres), suivie de l’apoptose.7

KSP est absent dans les neurones postmitotiques et est susceptible d’agir seulement dans

cellules qui se divisent, ses inhibiteurs pourraient fournir une meilleure spécificité que

inhibiteurs des microtubules dans le traitement des tumeurs malignes humaines.8 Un grand nombre d’inhibiteurs

échafaudages chimiques ont été signalés et certains d’entre eux, y compris

l’ispinesib (1) et le filanesib (connu sous le nom de ARRY-520, 2) ont été inclus dans les essais cliniques (Figure ​ Figure 11) .9 − 13 Bien que l’efficacité clinique de ces inhibiteurs

a été limitée à ce jour, de meilleurs résultats ont été obtenus récemment

dans le traitement des hémopathies malignes à base de thiadiazole

Les inhibiteurs de KSP, tels que le filanesib. Actuellement, filanesib subit

évaluation clinique en association avec des inhibiteurs du protéasome tels

comme bortézomib ou carfilzomib.14Figure 1Structure of

Inhibiteurs de KSP: ispinesib (1), filanesib (2), STLC (3), et les dérivés précédemment rapportés

(3a et 3b). Précédemment, nous avons rapporté la structure – relation d’activité

études (SARs) des dérivés de S-trityl-l-cystéine (STLC, 3) en tant qu’inhibiteurs de KSP (Figure ​ Figure 11) .15 Plusieurs STLC

dérivés, tels que les composés 3a et 3b avec un seul substituant para lipophile dans un cycle phényle de

le groupe trityle, était 4 à 10 fois plus puissant que le STLC original,

en termes d’inhibition de la KSP ATPase et de cytotoxicité cellulaire. Récemment,

nous avons montré que le composé 3a induit un arrêt mitotique par

l’activation du point de contrôle mitotique, qui a finalement conduit à indépendante de la caspase

mort cellulaire dans les cellules myéloïdes chroniques K562, 16 ainsi que démontré la capture de KSP dans les cellules en utilisant 3b immobilisé sur des billes d’affinité.17 Kozielski et ses collègues, qui ont contribué à la découverte de STLC

comme un inhibiteur de KSP, 18,19 ont résolu la structure cristalline

de KSP dans le complexe avec STLC, révélant qu’il se lie dans un allostérique

boucle L5 poche de liaison, comme c’est le cas pour la plupart des autres inhibiteurs allostériques.20 − 23 Récemment, ils ont signalé de nouveaux composés liés à STLC, où le soufre

atome dans STLC a été remplacé par CH2, et le triphenylbutanamine

les dérivés ont montré une bonne biodisponibilité orale et pharmacocinétique24,25. Selon leurs données, le groupe trityle de STLC était situé à

une région de base principalement hydrophobe et a été impliqué dans hydrophobe

interactions. En particulier, l’aromaticité et la configuration de

chaque anneau phényle dans le groupe trityle est important pour les interactions

tels que π – &#x003c0 ;, CH − &#x003c0 ;, et de face-à-face

interactions avec les chaînes latérales alkyliques de Glu215, Glu116 et Arg119

de KSP, respectivement. Sur la base de ces résultats, nous avons émis l’hypothèse que

le verrouillage de deux anneaux phényle avec des chaînes alkyle appropriées dans le

groupe trityl pourrait offrir une configuration qui permettrait hydrophobe

interactions et puissante liaison à KSP avec une perte réduite d’entropie.

Ici, nous décrivons une nouvelle série de dérivés STLC avec conformationally

groupes trityl contraints qui peuvent contribuer au développement de

inhibiteurs puissants de KSP. Nous avons également effectué une simulation d’amarrage de ces

nouveaux dérivés utilisant AMBER12 et fluorimétrie à balayage différentiel

(DSF) analyse26 pour enquêter sur le roman

interactions directes de ligand – De plus, nous avons démontré

que les dérivés représentatifs 5a – 5d et 6a ont significativement supprimé la croissance tumorale dans le

HCT116 xenograft modèle.Pour confirmer notre hypothèse, nous avons d’abord

préparé un dérivé réticulé avec un lieur d’éthylène entre

les anneaux phényle du groupe trityle dans STLC et évalué le inhibiteur

activité contre l’ATPase KSP. De manière encourageante, nous avons trouvé qu’un tel subtil

variation structurelle a abouti à composé 4, qui a exposé

une augmentation de 9 fois de l’inhibition de la KSP ATPase par rapport au STLC (figure ​ figure 22A). Pour améliorer notre

compréhension de la raison pour laquelle l’inhibition de la KSP ATPase a été améliorée

un composé conformationally contraint, nous avons déterminé un putatif

mode de liaison du composé 4 au sein de l’allostérique bien connu

poche de liaison de KSP. Le mode de liaison possible de 4 a été étudié par une expérience d’amarrage moléculaire via AMBER12 en utilisant

la structure cristalline précédemment rapportée de KSP dans le complexe avec un dérivé STLC substitué para-chloro (code PDB: 2xae) .22 Le composé 4 a été trouvé à quai dans un presque

manière complètement similaire à l’exception du linker d’éthylène (Figure ​ Figure 22B). Fait intéressant, notre modélisation

indiqué que le lien de l’éthylène de 4 participe

dans les interactions de van der Waals avec Tyr211 et Leu214 et CH − π

interaction avec Tyr211, participation qui n’a pas été vu dans le précédent

dérivés de STLC rapportés. En outre, ce mode de liaison suggéré

la faisabilité d’améliorer l’activité inhibitrice en introduisant

un substituant dans le cycle phényle non-lié. Nous avons donc décidé

de tenter d’autres SAR en fonction de l’optimisation des liens croisés

la taille de l’anneau et les effets de substitution de l’anneau phényle non lié

dans le groupe trityl (Figure ​ Figure22A). Figure 2: Simulation de conception et d’ancrage de nouveaux dérivés STLC. (Un design

du composé 4 et son optimisation chimique. (B) Amarrage

mode du composé 4 (gauche, gris, droit, cyan). La protéine

la structure de PDB 2xae a été utilisée pour l’amarrage. L’oxygène, l’azote, … Comme le montre le schéma 1, les composés cibles 4, 5a, j, 6a et 7a, 7b et 8a ont été synthétisés par la formation d’alcools tertiaires avant

thioéthérification avec de la cystéine en présence de trifluoroacétique

acide, comme décrit précédemment.15 Tertiaire

les alcools ont été préparés par la réaction de

cétones avec phényl lithium substitué. Le type de linker éthylène

des dérivés, tels que les composés 4 et 6c,

ont été publiés en tant qu’inhibiteurs du transport de la glycine pour le traitement neurologique

troubles neuropsychiatriques.27 Cependant,

il n’y a eu aucun rapport à ce jour de l’activité antitumorale avec

l’inhibition de KSP pour ces composés. Pour la cétone intermédiaire

du composé 8c, l’acide thiosalicylique 11 était

thio-alkylé par le bromure de phénéthyle et le carbonate de potassium comme base

pour donner l’acide 2- (phénéthylthio) benzoïque 12, qui alors

a subi l’acylation intramoléculaire Friedel – Crafts en utilisant polyphosphorique

l’acide pour obtenir la cétone cible. Comme pour les composés 7b, 8b et 8c, qui incorporent des chiraux

groupes trityles, analyse spectrale des mélanges diastéréoisomériques impliqués

qu’un mélange 1: 1 des paires (2R, 11R) et (2R, 11S) pour 7b et 8b, et (2R, 12R) et

Des paires (2R, 12S) pour 8c ont été formées. Les tentatives pour les séparer en utilisant HPLC se sont avérées infructueuses,

Nous les avons donc préparés et analysés en tant que mélanges de diastéréoisomères. Des comparaisons

entre les composés doivent donc être considérés dans une perspective SAR

comme relatif. Les processus de synthèse et les données physiques pour l’intermédiaire

et les composés finaux sont rapportés dans l’Information de Support. Schéma 1 Synthèse de Nouveaux Dérivés de STLCLes composés nouvellement synthétisés

ont été évalués pour l’inhibition de l’ATPase KSP et la cytotoxicité envers HCT116

cellules, ainsi que les composés précédemment rapportés (3, 3a et 3b) comme témoins et la clinique

repères candidats (1 et 2) (tableau 1). Nous avons d’abord étudié

les effets des substituants sur le noyau phényle non-lié dans le composé 4. Le plus encourageant, comparé à 4, l’introduction

d’un fragment 4-trifluorométhyle donne le composé 5a, qui

a montré une augmentation de 10 fois de l’inhibition de l’ATPase KSP et une augmentation de 30 fois

dans l’activité cytotoxique, tandis qu’un fragment 4-méthoxy a donné le composé 5b donnant une augmentation de 15 fois de l’inhibition de la KP ATPase et

une augmentation de 12 fois de l’activité cytotoxique. En outre, les composés 5c (4-Me) et 5d (4-Cl), avec des substituants de taille similaire

comme les composés 5a et 5b, également affichés excellent

Inhibition de KSP ATPase et cytotoxicité puissante. Comparé à 3, les composés 5a – 5d montraient

augmentation à deux chiffres de l’inhibition de la KSP ATPase et de 22 à 83 fois

augmente l’activité inhibitrice contre les cellules HCT116. Bien que la cytotoxicité

des composés 5a – 5d étaient moins puissants

que celle de 1 et 2, inhibiteur de la KSP ATPase

l’activité de ceux-ci étaient comparables. Nous avons ensuite étudié la taille et

position de substitution des substituants dans 4. Incorporation

d’un substituant 4-phényle (5e) a entraîné une perte de puissance,

tandis que les dérivés avec des substituants volumineux similaires (4-PhO, 5f, 4-tBu, 5g) étaient équipotents avec 4. En ce qui concerne les positions des substituants, les dérivés

avec 3-CF3 (5h) et 3-Cl (5i)

étaient mieux tolérés par rapport à 4, mais étaient plus de

10 fois plus faible que les dérivés 4-substituants correspondants.

De plus, 2-Me (5j) était plus de 10 fois plus faible

Ces résultats suggèrent qu’un petit lipophile

substituant à la position para est essentielle pour un niveau élevé de

Inhibition de KSP ATPase et activités cytotoxiques, comme indiqué dans notre

DAS précédents des dérivés du STLC.15 Ensuite, nous avons étudié la modification de la chaîne alkyle réticulée

et la taille de l’anneau. Parmi les dérivés 6a et 6d, qui ont les mêmes substituants que les composés 5a et 5d, respectivement, le remplacement du C – C

simple liaison avec une double liaison C = C a également permis inhibiteur puissant

activité contre l’ATPase KSP. Il convient de noter que les composés 6a et 6e ont montré une activité cytotoxique plus puissante

que les dérivés correspondants 5a – 5e, sauf 6e, avec une activité inhibitrice dans le seul chiffre

gamme nanomolaire. Bien que les raisons de cette cytotoxicité améliorée

n’étaient pas évidents, la cytotoxicité de ces dérivés

reflété différents niveaux de perméabilité cellulaire parce que le ClogP

la valeur d’un composé avec une double liaison a tendance à être plus élevé que celui

d’une simple caution.28 Remplacement du

C – C liaison avec C – O (7b) et C – S (8b) liaisons légèrement réduit l’activité inhibitrice de KSP ATPase

mais a conservé la cytotoxicité cellulaire par rapport à la correspondante

substituant de 5a. Fait intéressant, changer le lien

la taille de l’anneau dans le composé 5a conduit à une perte dramatique de puissance.

Le remplacement des deux atomes de carbone par O (7a), S (8a) et CH2 – CH2 & s01313; S (8c) a entraîné une perte substantielle de puissance. Ces SAR indiquent

cette restriction appropriée de l’anneau phényle rotatif dans le trityl

groupe a des effets favorables sur l’inhibition de la KSP ATPase et de la cytotoxicité

Activités. Ainsi, une taille optimale pour l’anneau lié, qui a un

longueur de chaîne alkyle réticulée de deux atomes et un seul lipophile

substituant para dans le noyau phényle non lié du groupe trityle,

est une exigence essentielle pour la puissante inhibition de la KSP par le

nouveaux dérivés STLC.Table 1Inhibitory Activity

sur la prolifération cellulaire KSP ATPase et HCT-116Nous avons ensuite effectué une analyse DSF26 pour étudier les interactions directes entre

les nouveaux dérivés STLC liés au cycle avec KSP. La capacité de stabiliser

KSP a été évalué en mesurant la stabilité thermique du natif KSP

protéine et le complexe protéique avec le ligand. Complexes de chaque

le composé a été chauffé par étapes en présence du colorant fluorescent

dont la fluorescence augmente quand il interagit avec le hydrophobe

résidus de la protéine. Ces résidus deviennent exposés au colorant

quand la protéine est dénaturée. Un décalage positif plus élevé de Tm par rapport aux complexes avec un inactif

composé, tel que la dibenzyl-l-cystéine (Δ Tm 0,0 ° C, KSP ATPase IC50 > 63.0 μ M),

signifie une plus grande stabilisation des complexes, ce qui est une conséquence

d’une liaison directe d’inhibiteur. L’expérience de contrôle positif utilisant 3 comme ligand a confirmé une amélioration significative de la stabilité

du complexe (Δ Tm 5.0 ° C)

En outre, comme prévu, le degré d’augmentation de la valeur de décalage Tm est corrélé avec la puissance de

Activité inhibitrice de KSP dans la série de composés (4, Δ Tm 8,0 ° C; 3b; Δ Tm 9,0 ° C; 5b; Δ Tm 12,0 ° C; 6b, Δ Tm 12,5 ° C; Figure ​ Figure 33A). Ces résultats suggèrent que les dérivés STLC

dans cette série se lient directement à KSP et que l’activité inhibitrice

dépend de la puissance de l’affinité de liaison KSP-ligand.Figure 3Affinité des dérivés STLC au domaine moteur KSP et effet

sur la prolifération cellulaire. (A) Composés interagissant avec et stabilisés thermiquement

Domaine moteur KSP en présence d’ATP. Les profils de fluorescence

de Sypro Orange obtenu en utilisant 4 μ M … We

précédemment démontré que 3a et 3b ont fait

n’inhibe pas l’activité ATPase d’autres kinésines telles que les

protéine E (CENP-E), enfant, KIF4 et protéine mitotique de type kinésine 1

(MKLP-1) .15 Les activités inhibitrices de l’ATPase

de dérivés nouvellement synthétisés tels que 5a et 5b ont été évalués pour ces protéines motrices. Ni ceux

kinésines ni évalué kinésines tels que KIF15 et KIF3C

ont été inhibés par 5a ou 5b (Information de support Figure S1). En outre,

une excellente corrélation positive entre l’inhibition de l’ATPase KSP et

la cytotoxicité cellulaire a été observée (tableau 1 et informations de support, figure S2). Nous avons ensuite étudié les effets sur la progression du cycle cellulaire.

Les valeurs de MI50 (50% de concentration d’induction de l’indice mitotique)

des composés 5a et 6a ont été corrélés avec

celle du niveau de cytotoxicité (5a, MI50 14 nM, 6a, MI50 12 nM) (figure ​ figure 33B). Analyse microscopique de

le phénotype mitotique des cellules traitées avec 5a ou 6a a montré la formation de fuseaux monopolaires, typique

phénotype de l’inhibition de KSP, dans toutes les cellules pendant l’arrêt mitotique (Figure ​ Figure 33C). Pris ensemble,

nous démontrons que les dérivés nouvellement conçus avec deux fusionnés

phényles dans le groupe trityle inhibent KSP dans les cellules et l’inhibition

de KSP a induit par la suite l’arrêt de phase M avec monoastral typique

phénotype.Les effets antitumoraux in vivo des composés représentatifs

ont été examinés dans le modèle de xénogreffe HCT116 (Tableau 2 et Informations de Support Figure S3). Pour améliorer la solubilité de ces candidats, un sodium

sel de chaque composé a été préparé sans aucune différence observée dans

activités in vitro (tableau explicatif S1). Les souris traitées ont reçu des composés sous forme d’injections intraveineuses

les jours 1, 3, 5, 8, 10 et 12. Les composés 4, 5a et 6a ont démontré une activité antitumorale dose-dépendante

dans ce modèle. A la dose de 150 mg / kg, le composé 4 inhibé

croissance tumorale (T / C: 23%). À la dose de 75 mg / kg, le composé 4 a montré une inhibition modérée de la croissance tumorale (T / C: 43%). Au même

dose, composé 5a, qui présentait environ 30 fois

augmentation de la cytotoxicité contre les cellules HCT116 par rapport à 4, était plus puissant (T / C: 9%). Alors que le composé 4 a montré une faible inhibition de la croissance tumorale (T / C: 62%) à une dose de 25

mg / kg, les composés 5a – 5d et 6a ont montré une suppression significative de la croissance des cellules HCT-116 (P < 0.00001) au jour 15. En ce qui concerne le changement de poids corporel

par le traitement composé, perte de poids corporel légère à modérée était

observé par rapport à la commande du véhicule (Informations de support Figure S3). Pour évaluer l’efficacité et la toxicité exactes

de ces composés, il est nécessaire d’optimiser la quantité, le calendrier,

et racine de l’administration. Cependant, aucune souris n’est morte pendant

le traitement sous la condition utilisée dans cette étude. Ces pharmacologiques

les études avec des modèles de xénogreffe HCT-116 ont démontré l’antitumor puissant

l’efficacité des dérivés de STLC avec des cycles phényle bloqués. Le plus

un groupe puissant des dérivés tels que les composés 5a – 5d et 6a dans les études in vitro ont également exposé

activité antitumorale puissante in vivo, ce qui suggère que l’activité antitumorale

de ces dérivés dépend de l’inhibition de la KSP dans la tumeur. Bien que

les détails de l’effet de ces dérivés sur le microenvironnement tumoral

encore à élucider, les dérivés STLC nouvellement identifiés

pourrait être des composés de plomb puissants pour le développement de la prochaine génération KSP

inhibiteurs et la fonction biologique de sondage de KSP dans le microenvironnement tumoral.Tableau 2Antitumor activité dans le modèle de xénogreffe HCT116 sur

Traitement avec des dérivés nouvellement synthétisésEn résumé,

une série de nouveaux dérivés STLC ont été conçus par une structure guidée

approche, et ceux ont été synthétisés et biologiquement évalués comme

Inhibiteurs de KSP. Les données SARs indiquent que les deux phényles liés

anneaux et le cycle phényle non lié avec un petit substituant para lipophile

dans le groupe trityl permis une meilleure liaison en occupant un hydrophobe

poche dans le site de liaison STLC. Les résultats de la modélisation ont indiqué que

Interactions de van der Waals entre les nouveaux dérivés STLC et KSP

pourrait contribuer aux améliorations observées dans les activités inhibitrices cancer de la thyroïde.

De nouveaux dérivés, tels que 5a – 5d et 6a – 6d, ont montré une inhibition puissante de l’ATPase KSP

et cytotoxicité cellulaire dans la gamme nanomolaire. En outre, excellent

une corrélation a été observée entre les activités inhibitrices. Analyse DSF

montré une liaison directe des dérivés STLC et KSP et a révélé

cette activité inhibitrice dépendait de la puissance de la liaison

affinité pour la protéine. Les composés représentatifs 5a et 6a ont arrêté les cellules en mitose, conduisant à la formation de

phénotype fuseau monopolaire. De plus, les composés 5a – 5d et 6a sont significativement supprimés

Croissance tumorale de xénogreffe HCT116 in vivo. Ainsi, les dérivés STLC

avec deux cycles phényle liés pourraient être de nouveaux composés de plomb dans le

conception de candidats cliniques pour les inhibiteurs de la KSP de prochaine génération

chimiothérapies antitumorales. Bien que les réponses cliniques limitées

ont été rapportés pour presque tous les inhibiteurs de KSP examinés en monothérapie,

l’utilisation d’inhibiteurs de KSP, tels que 2, en combinaison

avec d’autres médicaments anticancéreux pour améliorer les effets cliniques est encore

une perspective attrayante. D’autres études détaillées de ce roman STLC

série, y compris la cocristallisation aux rayons X, l’évaluation in vivo, et

l’exploration des biomarqueurs prédictifs est en cours.