Délivrance Virale Et Réponse Des Anticorps Chez Les Patients Atteints Du Syndrome Respiratoire Du Moyen-Orient Coronavirus Infection

Contexte Le syndrome respiratoire du Moyen-Orient Le coronavirus MERS provoque des cas isolés et des poussées de maladie respiratoire sévère Les caractéristiques essentielles de l’histoire naturelle de la maladie sont mal connuesMéthodes Nous avons étudié des patients adultes infectés par le coronavirus MERS pour une charge virale dans les voies respiratoires inférieures et supérieures. Le sang, les selles et l’urine Les anticorps et les activités neutralisant le sérum ont été déterminés au cours de la maladie. Résultats Quatre-vingt dix-neuf échantillons de LRT recueillis pendant les semaines suivant le diagnostic ont donné l’ARN du virus en% des tests. Trente-trois pour cent de tous les échantillons de sérum testés ont donné de l’ARN viral. Seulement% des échantillons de selles et% d’urine ont produit de l’ARN viral. Toutes les séroconversions sont survenues au cours des premières semaines après le diagnostic, ce qui correspond à la deuxième et la troisième semaine après l’apparition des symptômes Immunogl Tous les patients survivants, mais seulement un peu plus de la moitié de tous les cas mortels, ont produit des IgG et des anticorps neutralisants. Les taux d’IgG et d’anticorps neutralisants étaient faiblement et inversement corrélés avec les charges virales du LRT. Le moment et l’intensité de l’excrétion virale respiratoire chez les patients atteints de MERS correspondent étroitement à ceux des personnes atteintes de syndrome respiratoire aigu sévère article. L’ARN viral sanguin ne semble pas être infectieux Des locus extrapulmonaires de réplication du virus semblent possibles Les anticorps neutralisants ne suffisent pas à éliminer l’infection

MERS, charge virale, anticorps, excrétion, élimination Le syndrome MERS-CoV du syndrome respiratoire du Moyen-Orient a été isolé en Arabie Saoudite Depuis, au moins des cas confirmés en laboratoire d’infection au MERS-CoV, principalement avec des maladies respiratoires, ont été rapportés. ; Des cas connus et des foyers ont été signalés dans des pays de la péninsule arabique De grandes épidémies nosocomiales, comme à Djeddah, au Royaume d’Arabie saoudite et en République de Corée, ont démontré le potentiel du virus En raison de la nature sporadique de la maladie, avec des cas et de petites épidémies réparties sur une vaste zone géographique, l’investigation de l’histoire naturelle de l’infection a été limitée. Sauf pour les descriptions de cas individuels, des données chronologiques résumant Une meilleure connaissance de la cinétique d’excrétion virale provenant de différentes régions du corps pourrait aider à prévenir la transmission nosocomiale et à éclairer la gestion clinique. La connaissance des caractéristiques sérologiques, telles que la cinétique de production d’anticorps, pourrait guider les décisions concernant la transmission des anticorps. protocoles de diagnostic et de fournir des informations essentielles concernant l’immunité et l’élimination des virus Quant Les données itatives, telles que les charges virales et les titres d’anticorps, pourraient permettre des comparaisons avec des maladies apparentées, en particulier le syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS), pour lequel des études d’histoire naturelle ont été menées à la suite de l’épidémie.

MATÉRIAUX ET MÉTHODES

Patients et échantillons

Les patients ont été sélectionnés lors d’une flambée hospitalière entre mars et mai Il n’y avait pas de planification prospective du pouvoir statistique Les patients ont été sélectionnés pour le test MERS-CoV par RT-PCR en fonction de l’état clinique général, de la saturation en oxygène et de leur besoin. pour une ventilation invasive ou non invasive Des échantillons de patients positifs ont été prélevés au moins une fois par jour, à partir du – jour après le dépôt initial des échantillons pour le diagnostic MERS-CoV. Le délai moyen entre le premier prélèvement positif et le retour des résultats de laboratoire était de jours. Les échantillons stockés, pour analyse rétrospective, n’étaient pas disponibles. Les échantillons provenaient des sécrétions trachéales par des cathéters d’aspiration, de la gorge et des yeux avec des écouvillons stériles et de l’urine et des selles stériles. L’information de base sur les patients inscrits est fournie dans le tableau supplémentaire l’approbation du comité d’examen a été obtenue auprès du comité d’éthique de la recherche de Prince Sultan Military Medical City

Tests MERS-CoV RT-PCR

La RT-PCR en temps réel a été réalisée sur des extraits d’ARN en utilisant les gènes cibles upE et ORFA comme décrit dans Les concentrations d’ARN brutes ont été transformées en charges virales absolues par des facteurs de conversion, selon le type d’échantillon.

Isolement de MERS-CoV dans la culture cellulaire

L’isolement du virus, avec une sensibilité accrue par l’utilisation de cellules de carcinome du côlon humain CaCo, a été réalisé comme décrit dans

MERS CoV Sérologie

Dosage immunoenzymatique recombinant enzymatique

Un test ELISA immuno-enzymatique recombinant recombinant; L’IgG ELISA anti-MERS-CoV, Euroimmun, Lübeck, Allemagne était basée sur le domaine soluble de la protéine S de MERS-CoV exprimée dans les cellules HEK-T Le test a été réalisé comme décrit précédemment Les sérums ont été testés deux fois et la moyenne arithmétique des mesures a été utilisé

IgM Immunofluorescence Assay

La détection des anticorps IgM de l’immunoglobuline M a été faite en utilisant des lames d’immunofluorescence portant des cellules Vero infectées avec du MERS-CoV complet, comme décrit dans Corman et al Elles ont été converties en un format de réactif homogène par un fabricant de diagnostics in vitro. ; Euroimmun Tous les sérums étaient appauvris en anticorps IgG de l’immunoglobuline G en utilisant le réactif Eurosorb Euroimmun selon les instructions du fabricant.

Test de neutralisation du sérum

Un test de microneutralisation MERS-CoV NT a été réalisé comme décrit dans La prédilution avant la mise en place de la série log-dilution était:, définissant: comme le plus faible titre possible pour classer un échantillon comme positif

Analyses statistiques

Les analyses statistiques ont été effectuées à l’aide de la version du logiciel SPSS Dans tous les cas, des analyses de corrélation et des analyses de régression multiple préliminaires ont été effectuées pour exclure la confusion due à l’âge du patient ou à la durée de la maladie.

RÉSULTATS

Caractéristiques du patient

Pour déterminer les paramètres virologiques cinétiques dans l’infection MERS-CoV, nous avons suivi des patients hospitalisés L’âge moyen était de plusieurs années, et le pourcentage de patients masculins était une infection par le MERS-CoV dans tous les cas par RT-PCR Soixante-cinq pour cent de tous des patients sont décédés en cours d’étudeSéparation de génomes complets ou partiels des patients de l’étude a révélé l’existence de lignées virales au moins étroitement apparentées Figure supplémentaire et tableau Certaines séquences avaient déjà été vues dans une étude antérieure Les patients appartenaient au moins à la transmission nosocomiale Trois cas ne pouvaient pas être associés à des clustersAu moment du diagnostic positif, les patients avaient passé des jours à l’hôpital en moyenne, avec un maximum de jours Seuls les patients avaient été hospitalisés pendant moins d’une semaine. clusters et l’existence de comorbidités chez la plupart des patients, il était impossible de déterminer le jour de l’apparition La durée moyenne et médiane entre le début des symptômes et l’admission était de quelques jours, jours. Dans ces cas, la durée moyenne et médiane entre le début et le diagnostic était de plusieurs jours, – L’âge moyen des cas n’était pas significativement différent de l’âge moyen de tous les patients étudiés Pour fournir un point de référence commun dans l’évolution clinique de tous les patients, le jour du diagnostic du premier échantillon positif à la RT-PCR a été défini Comme le jour dans les analyses suivantesHuit cent vingt-trois échantillons des patients ont été testés, y compris des tests de charge virale dans différentes catégories d’échantillons Tableau supplémentaire En raison de la latence variable entre le diagnostic et l’enrôlement, les échantillons cliniques n’étaient pas répartis Figure supplémentaire

Détection de l’ARN viral transversal et cours de la charge virale

Les données sont illustrées à la figure et au tableau supplémentaire. Les échantillons de LRT des voies respiratoires inférieures avaient les charges virales les plus élevées, jusqu’à × copies / mL moyenne, × copies / mL Charges virales moyennes dans tous les autres cas. les types d’échantillons étaient significativement inférieurs au test t, P & lt; pour toutes les comparaisons Les essais d’isolement viral utilisant les échantillons de selles ayant la plus forte concentration d’ARN ont eu des résultats négatifs

Figure

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Charges virales chez les patients atteints du syndrome respiratoire du Moyen-Orient coronavirus MERS-CoV Charges virales moyennes dans les échantillons positifs par jour et type d’échantillon Les charges virales maximale et minimale sont représentées par des lignes violette et cyan, respectivement. les échantillons positifs sont résumés dans la figure supplémentaire

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Charges virales chez les patients atteints du syndrome respiratoire du Moyen-Orient coronavirus MERS-CoV Charges virales moyennes dans les échantillons positifs par jour et type d’échantillon Les charges virales maximale et minimale sont représentées par des lignes violette et cyan, respectivement. les échantillons positifs sont résumés dans la figure supplémentaire

Presque la moitié de tous les sérums ont montré des charges virales détectables au cours de la première semaine après le diagnostic des sérums testés. L’isolement du virus à partir d’échantillons viraux sériques avec et sans anticorps neutralisants a échoué malgré un protocole hautement optimisé. virémie dans sera Pearson R = -, P & lt; Cependant, l’ARN viral et les anticorps neutralisants ont été codétectés dans plusieurs cas, suggérant que l’ARN viral détecté ne représente que partiellement des virions infectieux. Figure A Les concentrations d’ARN dans le sérum ne sont pas significativement corrélées avec celles des échantillons prélevés le même jour. d’échantillons de sérum et de LRT; Corrélation de Spearman, P =; Figure B

Figure Vue largeDownload slideCorrélation de la détection de l’ARN viral viral avec des anticorps neutralisants et de la concentration d’ARN viral dans les échantillons respiratoires A, anticorps neutralisants; B, concentration d’ARN viral dans les échantillons des voies respiratoires inférieures Les colonnes vides dans les deux panels montrent une charge virale sérique. Les espaces vides représentent des échantillons sériques négatifs pour l’ARN viral.Vérification de la détection de l’ARN viral sérique avec des anticorps neutralisants et la concentration d’ARN viral dans les échantillons respiratoires. des anticorps; B, concentration d’ARN viral dans les échantillons des voies respiratoires inférieures Les colonnes dans les deux panels montrent la charge virale sérique. Les espaces vides représentent des échantillons sériques négatifs pour les virus. Les distributions de la charge virale LRT moyenne par patient ont été résumées dans les fenêtres temporelles suivantes. après le diagnostic, les charges virales moyennes n’étaient pas distribuées normalement mais présentaient une distribution asymétrique avec une prépondérance de patients avec une charge virale élevée. Les patients dans les catégories de charge virale les plus élevées dans le panneau supérieur de la figure ne montraient pas de augmentation de la proportion de résultats fatals χ test, P =

Figure Vue largeDownload slideDistribution des charges virales ARN dans les voies respiratoires inférieures Moyen-Orient syndrome respiratoire coronavirus coronavirus échantillons MERS-CoV dans les fenêtres temporelles Les colonnes montrent les charges virales pour chaque patient en moyenne sur les fenêtres temporelles indiquées à droite de chaque panneau. Échantillons moyens et varianceFigure View largeTélécharger les charges virales ARN dans les voies respiratoires inférieures Moyen-Orient syndrome respiratoire coronavirus MERS-CoV échantillons dans les fenêtres temporelles Les colonnes montrent les charges virales pour chaque patient en moyenne sur les fenêtres de temps indiquées à droite de chaque panneau distributions basées sur les moyennes et la variance de l’échantillonLa charge virale moyenne au cours de la première semaine après le diagnostic était de × copies / ml dans les cas mortels et de × copies / ml dans le test t avec survivants, P & lt; La divergence des charges virales entre les survivants et les cas mortels était plus prononcée dans la deuxième semaine × et × copies / mL, respectivement; P & lt;

Temps de production d’anticorps

Les traitements sérologiques ont pu être suivis pour les patients Près de la moitié de ces patients étaient déjà réactifs par ELISA le jour du diagnostic Parmi les patients ayant un suivi sérologique complet pendant la première semaine après le diagnostic,% n = avaient des anticorps en fin de semaine dans les deux ELISA et tests de neutralisation Dix-huit de ces patients ont été testés positifs à l’IgM par immunofluorescence. Titres d’IFA à la fin de la semaine Seuls les patients IgM positifs ne présentaient pas de résultat ELISA positif concomitant à la fin de la semaine. semaines de suivi sérologique séroconversion ELISA et tests de neutralisation Onze de ces patients ont développé des IgM détectables par IFA. La cinétique des anticorps a été moyennée sur tous les échantillons et les tests sont résumés sur la figure.

Figure Vue largeCartographie de la production d’anticorps La ligne rouge montre le titre moyen d’IgG de l’immunoglobuline G, représenté par les rapports de densité optique obtenus à partir du dosage immuno-enzymatique S ELISA La ligne orange montre le titre moyen d’IgM d’immunoglobuline M d’un test d’immunofluorescence. titrage de microneutralisation du virus Les titres NT de chaque patient sont moyennés sur des intervalles de temps successifs. Figure Cinétique de Décharge Cinétique de production d’anticorps La ligne rouge montre le titre moyen d’IgG d’immunoglobuline G, représenté par les rapports OD de densité optique obtenus à partir du dosage immuno-enzymatique. montre le titre moyen d’IgM d’immunoglobuline M d’un essai d’immunofluorescence IFA La ligne cyan montre le titre de microneutralisation du virus Des Titres NT de chaque patient sont moyennés sur des intervalles de jours successifs. Des informations sur le résultat étaient disponibles pour les patients avec un suivi sérologique. ELISA et NT pendant la première semaine Tous les anticorps IgM développés concomitamment Parmi les cas mortels, ont montré une séroconversion par ELISA avant la mort, la dernière séroconversion survenant après le diagnostic. Douze des cas mortels ont développé des anticorps neutralisants et ont développé des niveaux détectables d’ELISA. OD] et log NT pendant la première semaine après le diagnostic n’étaient pas significativement différents entre les cas survivants et mortels – test t interrompu, P = Au cours de la deuxième semaine après le diagnostic, les valeurs moyennes d’ELISA OD chez les survivants étaient significativement plus élevées qu’en test de t -tail, P & lt; En outre, les titres moyens des NT étaient plus élevés chez les survivants pendant la semaine, mais avec une discrimination moins importante que chez les survivants et les cas mortels, respectivement; test de t-queue, P & lt;

Corrélation des anticorps ELISA, des titres NT et des charges virales

Les valeurs ELISA OD et log NT ont été comparées aux charges logarithmiques virales dans les échantillons de LRT. Les données ELISA et de charge virale étaient disponibles sur la base des échantillons de sérum et de voies respiratoires appariés prélevés les mêmes jours, correspondant aux jours – postdiagnostic en raison de la charge de travail. Cependant, des données ELISA, NT et de charge virale combinées étaient disponibles auprès des patients, avec des ensembles de données appariés couvrant le diagnostic après jours. La figure supplémentaire résume la distribution des échantillons appariés au cours du temps Test de Pearson identifié corrélation linéaire significative entre les anticorps et les charges logarithmiques virales ELISA, R = -; NT, R = -; P & lt; dans les deux analyses Cependant, les résultats des tests d’ELISA et de NT sur les paires d’échantillons appariés n’ont révélé aucune preuve de l’existence de virus et d’anticorps mutuellement exclusifs. Figure A et B

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Effet des anticorps sériques sur les charges virales LRT des voies respiratoires inférieures Cette analyse est basée sur des échantillons de sérum et de LRT appariés prélevés chez un même patient le même jour. Les anticorps sont représentés par des graphiques linéaires. échantillons triés en fonction des niveaux croissants de dosage immuno-enzymatique ELISA densité optique DO rapports A ou titres d’anticorps neutralisants B Les numéros d’échantillons pour cette analyse sont résumés dans la figure supplémentaire.

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Effet des anticorps sériques sur les charges virales LRT des voies respiratoires inférieures Cette analyse est basée sur des échantillons de sérum et de LRT appariés prélevés chez un même patient le même jour. Les anticorps sont représentés par des graphiques linéaires. échantillons triés en fonction des niveaux croissants de dosage immuno-enzymatique ELISA densité optique DO rapports A ou titres d’anticorps neutralisants B Les numéros d’échantillons pour cette analyse sont résumés dans la figure supplémentaire.

DISCUSSION

En résumé, ni la concentration virale ni le moment de l’excrétion respiratoire ne permettent d’expliquer les différences de transmissibilité entre le MERS-CoV et le SRAS-CoV. Les données expérimentales suggèrent une plus grande sensibilité du MERS-CoV à l’interféron de type I associé à l’épithélium respiratoire, qui pourrait fournir une explication plausible de sa transmissibilité plus faible en comparaison avec le SRAS-CoV Beaucoup d’autres explications sont possibles, cependant la détection du MERS-CoV dans le sérum est une autre similarité avec le SRAS. les échantillons contenaient de l’ARN du SRAS-CoV durant la première semaine de maladie et environ% pendant la deuxième semaine Ces chiffres correspondent à nos observations pour le MERS La virémie libre semble peu probable comme cause de transmission nosocomiale du MERS, car aucun virus infectieux a été isolé du sérum Il y a des preuves de la réplication du SRAS-CoV dans les cellules mononucléaires du sang périphérique, les macrophages et les cellules dendritiques, quoique à des niveaux faibles [ Dans la présente étude, l’absence de corrélation entre la charge virale sérique et la charge virale LRT conduit à une réplication extrapulmonaire potentielle. La virémie, malgré la présence d’anticorps neutralisants, indique une région corporelle non accessible aux anticorps neutralisants mais libérant le virus dans le sang. Il a été montré que le CoV se répliquait dans plusieurs organes extrapulmonaires sans lésion tissulaire Un organe impliqué dans le MERS est le rein. Une insuffisance rénale a été rapportée dans de nombreux cas et le MERS-CoV a été isolé dans des cellules rénales exprimant le DPP, le MERS. Cependant, les éclosions associées aux soins de santé ont été centrées près des centres de dialyse et des services de néphrologie et ont touché des patients métaboliquement fragilisés qui sont prédisposés à l’insuffisance rénale lorsqu’ils souffrent d’une maladie systémique affectant la tension artérielle et la circulation sanguine. CoV a montré des taux de détection de l’ARN viral jusqu’à% dans l’urine , nous avons rarement trouvé Comme dans le SRAS, l’insuffisance rénale chez les patients MERS pourrait bien s’expliquer par une réaction inflammatoire sévère combinée à l’administration de médicaments potentiellement néphrotoxiques pendant les soins intensifs . Néanmoins, il sera très important d’effectuer une autopsie Dans le SRAS, la prévalence de l’ARN dans les échantillons de selles était si élevée que le test des selles a été proposé comme un moyen fiable de détecter la présence d’ARN viral dans les selles. La réplication active dans l’intestin avec isolement du virus vivant a été démontrée Pour MERS, nous avons trouvé des ARN associés aux selles dans seulement% des échantillons, avec une concentration d’ARN plutôt faible, et n’a pas réussi Dans l’isolement du virus infectieux Sur la base de ces données, l’excrétion fécale peut ne pas avoir joué un rôle important dans la propagation nosocomiale du MERS-CoV chez les patients sous étude comme dans le SRAS, La transmission nosocomiale MERS-CoV a été attribuée à plusieurs reprises au potentiel de certains patients à agir comme super-excréteurs ou super-étaleurs Notre analyse des charges virales, en particulier dans la phase aiguë précoce de la maladie, confirme l’existence d’un nombre limité de Patients présentant des charges virales extraordinairement élevées Comme ces patients n’étaient pas plus susceptibles de mourir de l’infection, ils n’auraient peut-être pas eu de symptômes plus sévères et auraient donc pu être en contact social malgré leur maladie. SRAS Les patients infectés par le SRAS ont été séroconvertis pendant des semaines et après l’apparition La plupart des patients étudiés ici avaient déjà subi une séroconversion la première semaine après le diagnostic, ce qui représente la deuxième semaine après le début du SRAS. limite son utilité diagnostique, en particulier lorsque l’on considère que les IgM dirigées contre des coronavirus humains plus prévalents peuvent présenter une réaction croisée avec le MERS-CoV [, Selon la méthodologie actuelle, les tests IgM devraient être limités aux cas nécessitant une preuve d’infection MERS-CoV récente et surmontée. L’information sur la valeur pronostique de la réponse anticorps dans le SRAS est moins claire Dans la présente étude sur MERS,% ELISA et% NT Cependant, les différences ne sont apparues que dans la deuxième semaine après le diagnostic, ne montrant qu’un faible effet protecteur contre les maladies pulmonaires. Le développement d’anticorps dans le sérum n’a pas été suivi d’une élimination rapide de l’ARN viral du virus. Les anticorps neutralisants incluent normalement l’IgA de l’immunoglobuline A sécrétée dans les fluides respiratoires et la salive. Nous avons récemment montré que l’IgA anti-MERS-CoV est sécrétée dans les liquides respiratoires , suggérant que le développement de l’IgA est trop tardif. dans la muqueuse infectée Sur la base de ces données, les vaccins contre le MERS-CoV devraient être conçus de manière à inclure et renforcer les réponses

Remarques

Remerciements Nous remercions Artem Siemens, Heike Kirberg, Monika Eschbach-Bludau, Sebastian Brünink, Stephan Kallies et l’Institut de virologie Tobias Bleicker, Bonn, Allemagne, pour leur excellente assistance technique. Nous remercions également Terry C Jones, Département de Zoologie, Université de Cambridge, Royaume-Uni, pour l’édition du manuscrit final Soutien financier Ce travail a été soutenu par le numéro de contrat PREPARE de la Commission européenne, ainsi que par la Deutsche Forschungsgemeinschaft DFG DR / -Potentiel conflits d’intérêts Tous les auteurs: Aucun conflit d’intérêt potentiel Tous les auteurs ont soumis le formulaire ICMJE pour la divulgation des conflits d’intérêts potentiels Les conflits que les éditeurs jugent pertinents pour le contenu du manuscrit ont été divulgués