Fonctionnalisé N, N-Diphénylamines comme Puissant et Sélectif EPAC2 Inhibitors

Les effets intracellulaires de

adénosine monophosphate cyclique (AMPc) sont médiés par intracellulaire

protéines effectrices avec des domaines de liaison cAMP conservés évolutifs

(CNBD) .1 Avant la découverte de l’échange

protéines directement activées par l’AMPc (EPAC) en 1998, médiées par l’AMPc

les événements de signalisation étaient censés être transduits en grande partie par la protéine

kinase A (PKA) .2,3 La découverte d’EPAC a changé

le paysage de la recherche sur la signalisation AMPc. Les preuves continuent d’émerger

soulignant l’importance d’EPAC et de sa relation complexe

PKA.4 − 6 Lors de la fixation de l’AMPc, les protéines EPAC activent la superfamille de Ras petite

GTPases Rap1 et Rap2.2,3 A ce jour, de nombreuses études ont montré

la signification physiologique et pathophysiologique des protéines EPAC7 et leur implication dans le cancer, 8,9 infections bactériennes et virales, 10,11 homéostasie énergétique

et l’obésité, 12,13 ainsi que les fonctions cardiaques.14,15 Étant donné que les protéines EPAC mammifères existent en tant que deux homologues structurellement

mais isoformes fonctionnellement non redondantes, EPAC1 et EPAC2,16,17 le développement d’inhibiteurs sélectifs de l’EPAC isoforme comme moléculaire

des sondes et des agents thérapeutiques potentiels sont nécessaires d’urgence. Ici nous rapportons

la conception, la synthèse, la caractérisation pharmacologique et moléculaire

d’amarrage des N, N-diphénylamines fonctionnalisées comme inhibiteurs puissants et sélectifs de l’EPAC2.

La campagne précédente de dépistage à haut débit (HTS) a conduit à

découverte de plusieurs résultats validés avec inhibiteur spécifique de l’EPAC

activité et a ensuite été suivie par une vaste chimie médicinale

optimisations.9,18 − 21 Parmi les identifications “ hits &#x0201d ;,

les échafaudages de diarylsulfone et d’arylsulfonamide liés à ESI-05

(1, Figure ​ Figure 11) ont été explorés pour élucider les relations d’activité structure –

(SARs) comme décrit dans nos travaux précédents.22 Ici, nous présentons la synthèse et l’activité biologique des N, N-diphénylamines structurellement

liés aux deux hits HTS ESI-05 (1) et ESI-10 (2) (Figure ​ Figure 11). L’approche générale décrite dans la Figure 11 était de conserver le 2,4,6-triméthylphényle

(mésityl) moitié ou A-ring de 1, un hydrophobe favorable

fragment d’antagonistes de l’EPAC identifiés dans des études antérieures.7 L’incorporation de divers électrons retirant

et donner des groupes avec des modèles de substitution différents dans le B-anneau

de la diphénylamine a été utilisé pour explorer les exigences électroniques de l’anneau B

optimiser l’activité inhibitrice de l’EPAC2 et la sélectivité. À cette fin,

une stratégie synthétique en une étape basée sur le Hartwig Buchwald –

protocole d’amination7 a été utilisé comme un facile

entrée aux inhibiteurs potentiels de l’EPAC2 (schéma 1, 3 – 32).

Fragments de B-anneau ont été choisis sur la base de nos résultats antérieurs, 17,19,22,23 disponibilité commerciale, et la capacité de couplage dans le décrit

protocole. La déméthylation du méthoxy et la réduction des groupes nitro

ont été atteints en utilisant des protocoles standard pour permettre 33 et 34, respectivement. Les protocoles synthétiques et détaillés

les données de caractérisation sont indiquées dans les informations de support (SI). Figure 1: Structures de cAMP, HTS hits ESI-05 (1) et ESI-10

(2), et conçu N, N-diphénylamines comme une nouvelle classe d’inhibiteurs EPAC2.Schéma 1Synthèse de N, N-diphénylamine

ScaffoldA a déjà décrit un test basé sur EPAC2 en utilisant un fluorescent

analogue nucléotidique cyclique 8-NBD-cAMP a été utilisé pour quantifier le test

ligands ’ capacité à prévenir la liaison de 8-NBD-AMPc à EPAC2.17,18 La liaison de 8-NBD-AMPc à EPAC2 purifiée conduit à une dose dépendante

augmentation du signal fluorescent, qui peut être inversée par cAMP ou EPAC2

antagonistes. Par conséquent, l’intensité de fluorescence peut être utilisée pour quantifier

la puissance des composés synthétisés en tant que valeurs IC50

(Tableau 1). Notre précédent

rapport publié HJC0338 (tableau 1), une diphénylamine qui était capable de prévenir 8-NBD-cAMP

liant à EPAC2. Cela a fourni la raison d’être d’enquêter davantage

un plus grand nombre d’analogues.22 Par conséquent,

les analogues du dichloro ont été synthétisés et évalués comme prometteurs

activité similaire aux composés précédemment rapportés, par exemple, 2,3-dichloro

dérivé (4, IC50 = 0,7 μ M) .22 Incorporation d’un méthyle dans le B-anneau prouvé

bénéfique comme le montre le 12 (3-chloro-2-méthyle, IC50 = 0,5 μ M). Incorporation de fluor, de brome et

trichloro / trifluoro a fourni peu ou pas d’augmentation de l’activité (6 – 10, 16 – 21). L’inclusion de trifluorométhyle conduit à des composés actifs. Comme

un exemple, 15 inhibition de l’EPAC2 démontrée (IC50 = 0,4 μ M). Alors que l’incorporation d’un seul méthyle,

trifluorométhyle, éthyle, diméthyle et autres fractions hydrophobes

pratiquement aucun gain d’activité inhibitrice (22 – 26, 28 – 30). Le 3,5 bis (trifluorométhyle)

les dérivés 27 et 2,4,6-triméthylés dérivés 31 présentent tous deux des activités inhibitrices prometteuses (IC50 =

0,6 et 0,4 μ M, respectivement). Incorporation de l’électron

donner 3-méthoxy, 3-hydroxy,

et des groupes 3-amino (33 – 34) fournis

pas de gain d’activité. Basé sur le SAR obtenu, l’hydrophobicité de

les deux cycles phényle reste essentiel pour l’activité inhibitrice,

avec nos antagonistes EPAC2 précédemment rapportés.17,19Plusieurs composés prometteurs, 12, 15, 27 et 31 (Figure ä Figure 22), ont été examinés pour la sélectivité entre

EPAC2 et EPAC1. Un test fonctionnel du facteur d’échange de nucléotide de guanine (GEF) in vitro17 précédemment décrit

a été utilisé pour évaluer la sélectivité étant donné que le test de liaison 8-NBD-AMPc

n’est utile que pour EPAC2, pas EPAC1 sous format HTS (Tableau 2, Figure ​ Figure 33). Les composés 12, 15, 27 et 31 ne montrent pas mesurables

Activité EPAC1 sous les doses testées dans le test rapporté (sans effet

jusqu’à 100 μ M) montrent encore une faible activité inhibitrice micromolaire

à EPAC2. Cependant, ESI-09, un antagoniste EPAC 1/2 non sélectif, est affiché

EPAC1 et EPAC2 activité inhibitrice dans les mêmes conditions (tableau 2, figure ​ figure33) .18 Cela suggère que les composés mentionnés ci-dessus représentent puissant

et des inhibiteurs d’EPAC2 hautement sélectifs. Fait intéressant, alors que chaque composé

inhibé l’activité EPAC2 GEF dans la même mesure (> 80% d’activité

ablation, Figure ​ Figure 33),

les mêmes composés

varient dans leur capacité à empêcher la liaison de 8-NBD-AMPc à EPAC2 (figure ​ figure 22). Le composé 27 a entraîné une diminution de la liaison de 8-NBD-AMPc d’environ

60%, tandis que les autres composés empêchent environ 80% de 8-NBD-cAMP

contraignant. Cependant, tous les quatre composés présentent presque le même inhibiteur

activité dans le test fonctionnel cavité. Cela suggère que l’EPAC2 testé

inhibiteurs peuvent non seulement empêcher la liaison de 8-NBD-AMPc, mais aussi promouvoir

une conformation qui diminue l’activité de GEAC EPAC2. Figure 2 Activité relative des inhibiteurs de EPAC2 12, 15, 27, 31 et AMPc; inhibition dose-dépendante

de 8-NBD-cAMP se liant à EPAC2; cercles ouverts, 12; ouvrir

carrés, 15; triangles ouverts, 27; fermé

cercles, 31; &#x000d7 ;, AMPc (n ≥

3). Figure 3: Activité de l’EPAC2 GEF médiée par l’AMPc.

en présence de 12, 15, 27 et 31,

et ESI-09; cercles rouges ouverts, 12; carrés ouverts, 15; triangles ouverts, 27; cercles fermés, 31; hexagones orange ouverts, ESI-09 (n = 3) .Tableau 1IC50 Valeurs des échafaudages fonctionnalisés N, N-diphénylamine dans 8-NBD-cAMP

EPAC2 Binding AssayTable 2IC50 Valeurs

de Select N, N-Diphenylamines dans

guanine médiée par l’AMPc

Le test d’activité du facteur d’échange des nucléotides (GEF) de EPAC2 ou EPAC1To permet de mieux comprendre

Sélectivité EPAC2, amarrage moléculaire

études ont été réalisées en utilisant le Schr ö Dinger Drug Discovery

Suite pour étudier les modes de liaison prédits de l’échafaudage N, N-diphénylamine et apo-EPAC2 (PDB # 2BYV; voir Expérimental

Méthodes dans le SI) .24 EPAC1 et EPAC2 contiennent tous deux un domaine de liaison à l’AMPc conservé

qui lie l’AMPc avec une affinité élevée (CNBD-B, figure ​ figure 44). Liaison de l’AMPc aux résultats CNBD-B

dans un changement conformationnel de EPAC qui expose la région catalytique

responsable de l’activation du Rap. Cependant, EPAC2 a un cAMP supplémentaire

domaine de liaison (CNBD-A) qui lie l’AMPc avec une faible affinité et est

pas nécessaire pour la régulation EPAC2 par AMPc.4 Fait intéressant, dans la structure apoino-EPAC2 autoinhibitory signalée,

CNBD-A et CNBD-B sont orientés l’un vers l’autre en formant une interface

qui bloque les deux cavités d’AMPc (Figure ​ Figure 44) .24,25 EPAC1 manque de cette interface, étant donné

qu’il ne contient que le CNBD-B. Par conséquent, il est concevable que

une petite molécule peut empêcher la liaison de l’AMPc (ou du 8-NBD-cAMP)

sonde utilisée dans le test décrit) à EPAC2 en pontant CNBD-A et

Domaines CNBD-B. Cela favoriserait la stabilisation de l’autoinhibition,

par rapport à l’état actif, une transition connue pour être très dynamique

pour EPAC.25 − 30 Cette interaction n’est pas possible pour EPAC1 car il lui manque l’interface.

Cette idée est supportée par le fait que notre HTS original 1 perd l’activité inhibitrice d’EPAC2 lors de la suppression de CNBD-A.31 De plus, 15 (1 μ M) ont agi

en tant qu’inhibiteur non compétitif de l’activité EPAC2 GEF médiée par l’AMPc

en produisant un décalage vers la droite de la dose et de la réponse de l’AMPc

en activation maximale (voir SI, Figure S1),

suggérant que ceux-ci, et des échafaudages similaires, peuvent accéder à un allostérique

site tel que l’interface de CNBD-A et CNBD-B. Non compétitif / allostérique

l’inhibition de EPAC1 a été proposée dans des rapports précédents de ligands

qui agissent au niveau de la région charnière entre CNBD-B et REM (figure ​ figure 44). Cependant, la région charnière

est hautement conservée dans les deux EPAC 1 et 2.32,33 Puisque les composés 12, 15, 27 et 31 inhibent sélectivement EPAC2 mais pas EPAC1, il

est raisonnable de suggérer que les composés susmentionnés interagissent

à l’interface des deux domaines de liaison AMPc dans la protéine EPAC2.

Par conséquent, l’amarrage moléculaire à l’apo-EPAC2 au CNBD-A et CNBD-B

l’interface a été réalisée avec les ligands 12, 15, 27 et 31. Les plus faibles poses d’énergie pour chaque

sont superposés sur la figure ​ la figure 55 montre une poche de liaison bien définie entre les domaines de liaison de l’AMPc.

Une vue agrandie de 15 et apo-EPAC2 (Figure ​ Figure66) prédit un cation de clé − π interaction

entre le cycle A riche en électrons et LYS 42 de CNBD-A et une liaison H

interaction entre la N, N-diphénylamine

N – H et le squelette amide carbonyle de HIS 335 de CNBD-B. Donc,

le fragment de mésityle privilégié et N – H combler l’écart entre

CNBD-A et CNBD-B dans EPAC2, stabilisant probablement les auto-inhibés

état, un mode de liaison qui n’est pas possible dans EPAC1 à condition que l’absence

de CNBD-A. En fait, tous les composés, sauf un, peuvent être ancrés

cette interface avec des résultats similaires indiquant qu’une base structurelle

exigence pour cette pose de liaison prédite est l’échafaudage de la diphénylamine.

Une exception, composé 30, n’est pas en mesure d’accéder à

site allostérique proposé en raison de sa taille, compatible avec le fait

ce composé 30 était inefficace pour prévenir le 8-NBD-cAMP

liaison (tableau 1).

De plus, les ligands avec de forts groupes donneurs d’électrons (− OMe,

− OH, − NH2; 32 – 34) affichent toujours des valeurs IC50 plus faibles que les autres

composés testés. Étant donné que l’amarrage indique que la N, N-diphénylamine N interagit

avec l’amide carbonyle de HIS 335 de CNBD-B, il est concevable que

− OMe, − OH et − NH2 perturbent l’avidité

de cette interaction H-liaison prédite en raison de leur π -donating

propriétés à travers l’anneau aromatique.Figure 4Domaines de protéines EPAC. Tous les membres de la famille EPAC

posséder un N-terminal

région régulatrice auto-inhibitrice et une région catalytique C-terminale.

La région de régulation contient un Disheveled, Egl-10 et Pleckstrin

(DEP) domaine et jusqu’à deux adénosine cyclique … Figure 5Lowest d’ancrage d’énergie pose superposition de 12, 15, 27, et 31 (bâton gris) avec auto-inhibé

apo-EPAC2 (ruban, code PDB: 2BYV); résidus clés LYS 42 et HIS 335 (bâtonnet bleu); CNBD-A

mis en évidence avec une ellipse orange; CNBD-B mis en évidence avec du bleu clair

ellipse. … Figure 6Zoomed-vue de l’amarrage d’énergie la plus basse pose de 15 (gris

bâton / treillis métallique) avec l’apo-EPAC2 auto-inhibée (ruban, PDB # 2BYV); résidus clés LYS

42 (bâtonnet bleu) de CNBD-A et HIS 335 amide (bâton vert) de CNBD-B.En résumé, une série de N, N-diphénylamine

dérivés ont été conçus, synthétisés et évalués systématiquement

en tant qu’inhibiteurs spécifiques de EPAC2. L’ancrage moléculaire a été utilisé pour

donner un aperçu des modes de liaison potentiels. Plus précisément, un allostérique

site unique à EPAC2 a été identifié et le ligand prédit – protéine

interactions ont été utilisées pour rationaliser les données SAR observées et devraient

stimuler de nouvelles stratégies vers l’inhibition des protéines EPAC. Composés 12 (CTW0151), 15 (MAY0132), 27 (CTW0181),

31 (CTW0167) n’a montré aucune activité substantielle à

l’EPAC1 hautement homologue tout en présentant une activité submicromolaire

à EPAC2. À notre connaissance, les composés 12, 15, 27 et 31 sont comparables à

le plus puissant de tous les inhibiteurs sélectifs de l’EPAC2 synthétisés

à ce jour. Ces composés, avec des profils physico-chimiques décents (c.-à-d.

efficacité du ligand avg = 0,41. avg tPSA = 13, moyenne Mw = 268, moyenne ClogP

= 5,4; voir SI, tableau S1), peut être utile

en facilitant nos efforts pour découvrir les rôles spécifiques à l’isoforme

des protéines EPAC. D’autres études pour améliorer la ressemblance médicamenteuse (p.

lipophilie et solubilité) de ces molécules tout en maintenant

activité / sélectivité sont en cours.