Spectre clinique de l’implication pulmonaire dans la leptospirose dans une région d’endémicité, avec quantification du fardeau leptospiral

Contexte L’implication pulmonaire dans la leptospirose reste peu reconnue dans les régions où elle est endémique, malgré les récentes épidémies et maladies épidémiques. Méthodes Une étude prospective a été réalisée pour identifier les patients fébriles exposés à Leptospira dans des contextes urbains et ruraux à Iquitos, au Pérou. Le diagnostic de leptospirose a été confirmé dans des cas pulmonaires par culture ou par PCR quantitative en temps réel. Résultats des patients fébriles inscrits consécutivement,% ayant des anticorps IgM antileptospiraux ou des titres élevés d’anticorps antileptospiraux Sept patients ayant des antécédents de seule l’exposition urbaine aux leptospires présentait de graves manifestations pulmonaires; parmi ceux-ci, les patients sont morts; des décès ont été causés par une hémorragie pulmonaire, et ont été causés par un syndrome de détresse respiratoire aiguë et une défaillance multiviscérale. La PCR quantitative en temps réel a montré des niveaux élevés de leptospirémie ⩾ leptospires / mL dans la plupart des cas mortels; Le patient, dont les prélèvements de tissus ont été obtenus à l’autopsie, a présenté: ⩾ leptospires / g de tissu pulmonaire, rénal et musculaire. Cette étude démontre le sous-diagnostic de la leptospirose dans une région de forte endémicité et la non reconnaissance des complications pulmonaires graves. dans les zones urbaines mais non rurales Le traitement présomptif de la leptospirose doit être initié immédiatement dans le contexte épidémiologique et clinique approprié

Au cours de la dernière décennie, l’hémorragie pulmonaire a été reconnue dans le monde entier comme une manifestation grave de la leptospirose Les médecins des régions où la maladie est endémique ne reconnaissent souvent pas l’association pulmonaire avec la leptospirose. Méthodes de diagnostic disponibles telles que l’agglutination microscopique Les cliniciens considèrent généralement la leptospirose dans le diagnostic différentiel d’une fièvre indifférenciée aiguë, mais seulement lorsque les patients présentent des manifestations de manuels classiques, comme la triade de la fièvre, En outre, lorsque les patients présentent des formes moins courantes de leptospirose , comme dans l’épidémie de leptospirose entraînant une hémorragie pulmonaire survenue au Nicaragua, le diagnostic est souvent non pris en compte ou seulement découvert à l’autopsie Ce rapport démontre que Le sous-diagnostic de la leptospirose et la sous-reconnaissance de l’atteinte pulmonaire sévère de cette maladie dans une région de forte endémicité La leptospirose pulmonaire était présente chez les sujets vivant en zone urbaine et non rurale Un test PCR quantitative en temps réel a permis un diagnostic rapide de leptospirose dans les cas graves. les cas d’atteinte pulmonaire de la leptospirose, les premiers signalés au Pérou, soulignent à nouveau la grande importance de ce syndrome pour la santé publique Des mesures de surveillance et de contrôle appropriées doivent être mises en place dans cette région et dans des régions similaires

Méthodes

ter de ⩾ Protection des sujets humains Cette étude a été approuvée par les Comités d’éthique de l’Universidad Peruana Cayetano Heredia et de l’Asociación Benéfica PRISMA, Lima; l’hôpital de Apoyo Iquitos, Iquitos; et la Direction de la Santé DISA, Loreto, Pérou; Les patients ont été cliniquement gérés par des médecins péruviens locaux selon les normes régionales. Dès que les patients ont été identifiés par l’équipe de l’étude comme ayant une éventuelle leptospirose sévère, les médecins traitants ont été invités à administrer antibiotiques appropriés par voie orale, ceftriaxone ou pénicilline et traitement de soutien. Essais sérologiques Des échantillons de sang veineux ont été prélevés dans des tubes Vacutainer Becton-Dickinson sans anticoagulant et transportés jusqu’au laboratoire d’étude à température ambiante. Le sérum a été séparé, congelé en aliquotes à – ° C et transporté sur glace sèche au laboratoire national de référence de la leptospirose à l’Instituto Nacional de Salud de Lima, où la présence d’anticorps antileptospiraux a été déterminée. Un ELISA incorporant des souches de sérovars pathogènes-Icterohaemorrhagiae RGA, Australis Ballico, Bratislava Jez Bratislava, Ballum MUS, Canicola Hond Utretch IV, Cy nopteri C, et Grippotyphosa Moskva V-a été utilisé pour détecter les anticorps IgM antileptospiraux MAT a été réalisée en utilisant des antigènes leptospiraux, en utilisant le panneau Centers for Disease Control and Prevention plus Leptospira biflexa sérovar Patoc Patoc I et une souche antigéniquement distincte de Leptospira obtenu chez un sujet fébrile à Iquitos provisoirement désigné Leptospira sp souche Var, avec une autre classification taxonomique en attente Les titres MAT sont rapportés comme l’inverse du nombre de dilutions encore agglutinant% d’antigène bactérien vivant Leptospiraculture d’échantillons cliniques Le sang de chaque patient a été inoculé à Serologicals Corporation complété avec μg / mL de -fluorouracile et μg / mL de néomycine Les échantillons d’urine ont été ajustés au pH avec% d’hydroxyde de sodium au moment de la collecte, puis inoculés dans des milieux de culture. Les cultures ont été transportées au laboratoire d’étude. à température ambiante dans h après avoir été dans itié, incubé à ° C- ° C, examiné chaque semaine par microscopie à fond noir, et jeté à semaines si les résultats étaient négatifs. Les isolats ont été identifiés en utilisant MAT pour sérogroupage; l’identification au niveau du sérovar n’a pas été réalisée. Des antisérums polyclonaux de lapin disponibles dans le commerce ont été utilisés pour isoler les isolats de sérotype PFGE et le séquençage du gène ribosomique S a été effectué selon les procédures standard ; l’outil de recherche d’alignement local de base et l’analyse Clustal W version DNASTAR ont été utilisés pour déterminer les relations entre les séquences du gène S chez les isolats de leptospires, pour référencer les séquences d’espèces de Leptospira dans GenBank et pour construire des arbres phylogénétiques à des fins d’identification. ; Le séquençage du gène S et l’analyse PFGE ont également été effectués à l’Université de Californie à San Diego en collaboration avec le Laboratoire de référence sur la leptospirose au Centre de contrôle et de prévention des maladies à Atlanta. Les profils PFGE ont été obtenus pour les sérovars leptospiraux Leptospiral isole le sérogroupe Icterohaemorrhagiae, Grippotyphosa, Canicola, Var de la région d’Iquitos en tant que base de données de référence, par rapport auquel nous avons comparé les patrons PFGE des isolats obtenus dans cette étude. La suite logicielle Phoretix D a été utilisée pour analyser et comparer quantitativement le PFGE. La PCR en temps réel a été réalisée pour confirmer le diagnostic de la leptospirose uniquement chez les patients présentant des manifestations pulmonaires. L’ADN a été extrait à partir de μL de sérum, de sédiments d’urine centrifugés à, g, ou mg de tissu obtenu à la nécropsie, en utilisant, dans tous les ases, le kit d’extraction d’ADN Qiagen Tissu Qiagen Le test PCR en temps réel est basé sur la chimie TaqMan qui détecte spécifiquement les gènes ribosomaux pathogènes de Leptospira S au moyen d’une méthode publiée ; La seule modification dans le test est l’utilisation de la sonde fluorescente à une concentration finale de μm A ADN Moteur Thermocycleur Opticon MJ La recherche a été utilisée pour les tests effectués sur site dans notre laboratoire de terrain à Iquitos. Les courbes standards pour la quantification ont été réalisées avec Leptospira interrogans. Icterohaemorrhagiae et dénombrés à l’aide d’une chambre de comptage Petroff-Hausser sur un microscope à fond noir Des puits sans gabarit ont été inclus dans chaque analyse pour détecter la présence d’analyses DNAStatistiques contaminantes. Nous avons utilisé un test d’échantillonnage de proportions avec un niveau de confiance en%. les hypothèses alternatives ont été testées par rapport à la null les proportions sont similaires Nous avons utilisé le logiciel statistique STATA, version STATA

Résultats

Dans le cadre d’une étude prospective, hospitalière et populationnelle de la fièvre aiguë dans la région d’Iquitos, les patients ont été recrutés de juin à mars. Les patients ont été étudiés à l’hôpital urbain d’Apoyo Iquitos et dans les centres de santé des environs d’Iquitos Les taux d’exposition leptospirale, tels que définis par les tests sérologiques ELISA IgM ou MAT, étaient similaires dans les populations hospitalières et communautaires Les taux de suivi étaient plus élevés dans les zones rurales, principalement parce que ces patients étaient plus susceptibles d’être résidents permanents de le bassin versant, alors que les patients dans les hôpitaux dans les zones urbaines viennent souvent de lieux éloignés et le suivi était difficile

Vue de la table grandTélécharger la diapositiveRécapitulatif de l’inscription et du suivi dans une étude de la leptospiroseTable Voir grandDownload slideRésumé de l’inscription et du suivi dans une étude sur la leptospiroseDans la communauté rurale, aucun cas de leptospirose pulmonaire grave n’est survenu parmi les patients inscrits. population de patients,% des patients présentant des signes sérologiques d’exposition à Leptospira présentaient des formes pulmonaires sévères: les patients avaient une hémoptysie; syndrome de détresse respiratoire aiguë sans tableau d’hémoptysie Aucun cas de maladie de Weil typique ie, jaunisse ou insuffisance rénale ont été observés La sévérité de la maladie différait significativement entre sujets urbains et ruraux Tableau Cinq patients sont décédés, dont hémoptysie et ARDS et insuffisance multiviscérale patient hospitalisé avec hémoptysie est resté ambulatoire et a été traité présomptivement pour la tuberculose pulmonaire sans effet évident, et la résolution de la maladie est survenue simultanément avec l’auto-administration de l’amoxicilline Un patient hospitalisé patient survécu après plusieurs jours d’hémoptysie Une autopsie partielle d’un patient hémoptysique et est mort d’une insuffisance respiratoire, le sommet avait une atteinte hémorragique complète de la partie inférieure droite du poumon; D’autres organes abdominaux semblaient grossièrement normaux Il n’y avait pas d’autres signes d’hémorragie viscérale, mais des saignements de la muqueuse ont été observés dans les lèvres et les gencives.

Vue de la table grandTélécharger la diapositiveRésumé de l’information clinique sur les patients atteints de leptospirose pulmonaire graveTable View largeTélécharger la diapositiveRésumé de l’information clinique sur les patients atteints de leptospirose pulmonaire grave

Figure Vue largeTélécharger la diapositiveTest radiographique et aspect grossier du bas du poumon droit inférieur d’un patient, un homme d’un an qui est décédé d’une hémorragie pulmonaire leptospirale La radiographie thoracique montre des infiltrats alvéolaires diffus et épars avec une prédominance du lobe inférieur. largement hémorragique et friable; la partie montrée a été obtenue à travers le diaphragme par une incision péri-ombilicale parce que seulement une nécropsie partielle a été autorisée. Vue de dessusDownload slideChest radiographie et apparence grossière du bas du poumon droit du patient, un homme âgé de dix ans qui est mort d’une hémorragie pulmonaire leptospirale La radiographie thoracique montre des infiltrats alvéolaires diffus, épars, avec une prédominance des lobes inférieurs. Le poumon inférieur droit était largement hémorragique et friable; la portion montrée a été obtenue à travers le diaphragme par une incision péri-ombilicale car seule une nécropsie partielle a été autorisée. Le diagnostic de leptospirose a été confirmé pour tous les patients avec des cas sévères par une combinaison de tests sérologiques, de culture et un test PCR en temps réel. figure Trois patients patients, et ont eu des hémocultures positives; Les isolats ont été identifiés comme L interrogans sérovar Icterohaemorrhagiae, et a été identifié comme L interrogans sérovar Canicola Un patient patient avait un titre MAT contre la souche Var, et un test PCR en temps réel a révélé des leptospires pathogènes dans l’urine du patient Un patient qui avait un Le titre de MAT, a également eu des résultats négatifs de culture de sang et d’urine, mais des résultats positifs de PCR en temps réel ont été réalisés sur les urines quelques jours après l’inclusion dans l’étude. Le patient décédé d’une septicémie hémorragique accablante et d’une hémoptysie avait des résultats négatifs en culture de sang et d’urine, mais une PCR en temps réel avait révélé une Leptospira pathogène dans l’urine.

Figure Vue largeDownload slideQuantification de la charge leptospirale chez les patients présentant des manifestations pulmonaires graves de leptospirose Les numéros de patients correspondent aux descriptions des patients dans le tableau Les barres indiquent le nombre de leptospires par millilitre de sérum ou d’urine, ou par patient par g de tissu obtenu à l’autopsie par un test de réaction en chaîne de la polymérase en temps réel voir Matériaux et méthodes La ligne reliant les points de données pour le patient représente des échantillons d’urine séquentiels D, jour, cas mortel Voir grandDownload glissementQuantification de la charge leptospirale chez les patients présentant des manifestations pulmonaires sévères de la leptospirose descriptions des patients dans le tableau Les barres indiquent le nombre de leptospires par millilitre de sérum ou d’urine, ou par patient par g de tissu obtenu à l’autopsie, tel que déterminé par un test de réaction en chaîne par polymérase en temps réel. le patient représente l’urine séquentielle sa Les patients avaient des leptospires / mL de sérum et le patient avait des leptospires / mL de sérum Un patient patient dont les échantillons de tissus avaient été analysés par PCR en temps réel avait ⩾ leptospires par g de tissu Un patient avec une hémorragie pulmonaire ayant survécu le patient a continué à avoir la leptospirurie pour & gt; journées

Discussion

Les vasculitides auraient pu expliquer les présentations cliniques que nous décrivons. Sans étude spécifique de la leptospirose dans le cadre de la surveillance continue d’une étude écologique et épidémiologique, nous n’aurions pas posé le diagnostic de leptospirose pulmonaire grave, malgré ses implications pour l’institution de la Sur la base des souches leptospirales identifiées dans cette étude et dans d’autres études en cours, des mesures de lutte contre les porteurs de sérovar Icterohaemorrhagiae et de souche Var [Vinetz, observation non publiée] et de chiens porteurs du sérovar Canicola Premièrement, nous nous sommes appuyés sur les tests sérologiques comme principal moyen d’identifier l’exposition à Leptospira dans les populations de patients étudiés MAT et ELISA ont simplement révélé la présence de titres élevés d’anti- Certains chercheurs dans le domaine de la leptospirose utiliseraient les critères utilisés dans cette étude comme preuve de la leptospirose aiguë Les études qui ont utilisé des tests sérologiques pour diagnostiquer la leptospirose aiguë dans les régions d’endémicité ont utilisé des valeurs de coupure élevées, à savoir, MAT des titres de ⩾ dans les zones de non endémicité ou ⩾- dans les zones d’endémicité pour renforcer la spécificité du test de diagnostic de l’infection aiguë Cependant, les titres MAT de ⩾ ne sont pas rares chez les individus ambulatoires asymptomatiques dans les villages ruraux de la région d’Iquitos Vinetz , Segura, Gilman et Cespedes, données non présentées Par conséquent, dans la présente étude, nous interprétons les résultats des tests sérologiques uniquement comme une indication de l’exposition probable probable aux leptospires Cette étude sous-estime probablement le taux de létalité de la leptospirose aiguë. de l’hémorragie pulmonaire leptospirale en raison de la très forte prévalence de titres élevés d’anticorps antileptospiraux dans les Étant donné le niveau élevé d’exposition aux leptospires dans nos populations étudiées, il est possible que le nombre de patients ayant des titres élevés d’anticorps antileptospiraux ait provoqué une surestimation du nombre de patients fébriles qui souffraient réellement de leptospirose aiguë. estime que ~% des patients ayant des titres élevés d’anticorps antileptospiraux dans les Iquitos urbains présentaient une atteinte pulmonaire sévère, avec un taux de létalité global de%. Deuxièmement, certains patients ont été perdus de vue, ce qui a potentiellement entraîné une sous-estimation du nombre de patients qui a développé une leptospirose pulmonaire sévère La conception de l’étude comprenait une surveillance active des patients hospitalisés, et le suivi ambulatoire a été couronné de succès pour plus de% des patients inscrits, avec le plus haut taux de perte de suivi à l’Hospital de Apoyo Iquitos. certains patients perdus de vue parce qu’ils n’étaient que des habitants temporaires d’Iquitos pourraient avoir eu de graves eptospirose Si cela était vrai, le nombre de cas graves de leptospirose aurait été sous-estimé. De plus, avec notre présence continue dans les districts ruraux et une excellente communication avec les postes de santé villageois, nous aurions probablement appris des cas graves de maladie dans le district. Cependant, les données étayent notre conclusion selon laquelle la leptospirose sévère dans la région d’Iquitos est principalement un problème urbain. La leptospirose continue de sévir dans la région d’Iquitos. En raison de sa présentation clinique variable et souvent non spécifique A Iquitos, au Pérou, la leptospirose semble être une cause hautement significative de morbidité et de mortalité, bien plus que ce qui a été jusqu’ici reconnu. Les résultats des tests sérologiques leptospiraux sont encore difficiles à interpréter. régions où l’exposition aux leptospires est fréquente, des tests diagnostiques plus efficaces Ces modalités de test pourraient être basées sur la PCR, telles que celles présentées ici et ailleurs , ou elles pourraient inclure des tests de détection d’antigènes Tous les patients hospitalisés dans cette étude ont reçu un traitement antimicrobien approprié lors de la présentation; Les patients ambulatoires n’ont pas reçu ce traitement parce qu’ils sont rentrés chez eux avant le diagnostic ou avant l’hémoptysie. Il reste difficile de savoir si l’initiation d’un traitement antimicrobien aurait un impact sur le pronostic de la leptospirose pulmonaire sévère, mais il est clair que les antimicrobiens ne peuvent être retenus. L’amélioration de la surveillance n’est possible qu’en engageant les autorités de santé publique à maintenir l’intérêt et le soutien des établissements de diagnostic de la leptospirose qui peuvent fournir des informations diagnostiques avec un délai d’exécution cliniquement pertinent, et en éduquant le public dans les régions d’endémicité.

Remerciements

Nous tenons à remercier vivement le Dr Fernando Llanos, ex-Jefe, Instituto Nacional de Salud, Lima, Pérou, Dr Carlos Vidal, Directeur, et le Dr Hugo Rodríguez, épidémiologiste, de la Dirección de Salud DISA, Iquitos, Pérou, Nous remercions également Paul Levett, PhD, et Rene Galloway des Centres de contrôle , Atlanta, pour leurs efforts de collaboration dans l’identification moléculaire des isolats de leptospires réalisée dans cette étude. Remerciements à Flor Pacheco, Fabiola Diaz, Gladys Nahir Chuquipiondo, Juana Calderón, Sandra Cubas à Iquitos, et Lourdes Balda et Dana Gonzalez à l’Instituto Nacional de Salud, Lima, pour leurs contributions en laboratoire et sur le terrain à la présente étude; Nous remercions également les Docteurs Joshua Fierer, Carlton Evans et Katherine Remick pour leur critique du manuscrit et leurs suggestions utiles. Nous sommes reconnaissants à MJ Research pour son généreux soutien et ses précieux conseils techniques dans le domaine de la recherche. Temps PCR diagnostic assayFinancial support Un financement a été reçu du Fogarty International Center, des National Institutes of Health des États-Unis et de l’Institut national des sciences de la santé des États-Unis (RTW); Tutoriel sur la santé tropicale à JHU / Pérou Overseas Sites TG- subvention TAI; Le National Institutes of Health des États-Unis / Fogarty International Centre accorde le DTW, le DTW et le DTW ainsi que le fonds de recherche en médecine tropicale anonyme RG-ER