Utilisation efficace des méthodes évolutives pour le diagnostic en laboratoire de l’infection à Clostridium difficile

Les médecins doivent comprendre les caractéristiques de performance des tests de laboratoire en évolution utilisés pour diagnostiquer l’infection à Clostridium difficile s’ils intègrent correctement les résultats des tests à l’information clinique et formulent une intervention thérapeutique appropriée pour les patients atteints de diarrhée associée aux antibiotiques.

Clostridium difficile est un pathogène nosocomial émergent important Les individus peuvent être asymptomatiquement colonisés par le C difficile, et le taux de portage est plus élevé chez les patients hospitalisés que dans la population générale Le traitement antimicrobien précède souvent l’infection gastro-intestinale à C. difficile et contribue vraisemblablement à son apparition en modifiant l’équilibre de la flore intestinale Historiquement, la clindamycine, les céphalosporines, L’utilisation accrue de fluoroquinolones a propulsé cette classe en tête de liste des antimicrobiens associés aux ICD . Aux Etats-Unis, l’ICD représente% -% des antibiotiques nosocomiaux. diarrhée associée et est la principale cause d’antibiotiques infectieux diarrhée associée à c Des milliards de dollars de soins de santé sont dépensés annuellement pour le traitement de l’ICD, et les coûts devraient augmenter, car le nombre de cas et la gravité de la maladie augmentent régulièrement L’émergence de la BI / La souche NAP / toxinotype III représente la plus grande partie de cette augmentation de fréquence et de gravité, mais pas toute, et a contribué à l’augmentation des taux de mortalité [,,] Il y a eu une augmentation disproportionnée de l’incidence et de la mortalité chez les patients. Il est important de noter que les cas d’infection nosocomiale acquis dans la communauté sont moins susceptibles d’être associés à une exposition antécédente aux antibiotiques que les cas nosocomiaux Diagnostic rapide et précis de l’ICD pour le traitement et la prévention est cruciale dans ce contexte de risque accru, d’incidence accrue d’infection et de morbidité et de mortalité accrues% -%

BACTÉRIOLOGIE

Le C difficile est un bacille anaérobie à Gram positif, produisant des toxines et produisant des toxines qui a été décrit pour la première fois comme composant de la flore intestinale chez les nouveau-nés en bonne santé. Son nom reflète les difficultés rencontrées par les chercheurs qui tentent d’isoler et de cultiver ces Clostridia. Les caractéristiques phénotypiques de cet organisme comprennent une odeur de «cheval stable» causée par la production de p-crésol et une fluorescence jaune avec l’illumination de la lampe de Wood C difficile forme des spores résistantes à la chaleur et à la dessiccation; cette caractéristique permet la survie à long terme dans des environnements défavorables et la résistance à la désinfection, et contribue à l’épidémiologie et à la pathogenèse de l’organisme. En cas d’exposition à des conditions favorables, la formation de spores est inversée. qui favorisent la formation de spores ou la conversion à un état végétatif ne sont pas complètement compris

PATHOGÉNÈSE

Le génome du C difficile a été complètement séquencé, mais tous les mécanismes moléculaires par lesquels le C difficile cause le CDI sont complètement compris Par exemple, la mécanique de la colonisation intestinale et les éléments régulateurs importants pour l’expression des gènes de virulence sont mal décrits. Cependant, les toxines responsables de la médiation de la plus grande partie des manifestations cliniques de l’infection ont été identifiées et caractérisées de manière détaillée par les gènes tcdA et tcdB, respectivement la toxine A du TcdA et la toxine B du TcdB. ] Ces protéines partagent% d’homologie d’acides aminés et sont des glucosyltransférases qui inactivent les protéines liant le GTP RHO impliquées dans l’organisation du cytosquelette cellulaire et d’autres fonctions cellulaires Cette activité est le mécanisme primaire par lequel ces toxines agissent pour altérer la perméabilité intestinale et inflammation associée à un col pseudomembraneux CDI itis TcdA et TcdB sont capables d’intoxiquer les cellules épithéliales intestinales in vitro et de provoquer une pathologie intestinale lorsqu’elles sont administrées à des animaux. En utilisant des modèles d’infection, les études visant à étudier la contribution relative de ces toxines à la pathogenèse ont été contradictoires; une étude a montré que TcdB mais pas TcdA était nécessaire pour la virulence, alors qu’une autre étude a démontré que les deux toxines sont individuellement capables de provoquer une infection mortelle dans le modèle du hamster à C. difficile. La plupart des isolats cliniques sont capables d’exprimer TcdA et TcdB , alors qu’un sous-ensemble ne produit que TcdB; TcdA TcdB- les isolats cliniques sont extrêmement rares Certaines souches de C difficile ne produisent aucune toxine et sont donc non pathogènes. Elles peuvent coloniser asymptomatiquement le tractus gastro-intestinal et doivent être distinguées des isolats toxigènes par des tests diagnostiques. / NAP / O a été identifié Les résultats génotypiques caractéristiques de ces isolats comprennent la présence de gènes de toxine supplémentaires cdtA et cdtB qui codent la toxine binaire CDT du C difficile, un facteur de virulence putatif et des mutations dans tcdC qui peuvent déréguler l’expression de tcdA et tcdB Phénotypiquement, ces isolats sont résistants aux fluoroquinolones Bien que le sous-typage génétique des isolats de C difficile soit possible en utilisant diverses méthodes, et que la performance de certaines méthodes d’essai puisse être influencée par le génotype, il n’existe actuellement aucune preuve que la caractérisation génotypique prise en charge clinique de l’ICD

PRÉSENTATION CLINIQUE ET MÉTHODES DE DIAGNOSTIC

Les caractéristiques cliniques de l’ICD sont souvent difficiles à distinguer de celles des autres causes de diarrhée associée aux antibiotiques. La plupart des patients présentant une diarrhée qui a une odeur caractéristique de «cheval stable» Bien que la reconnaissance des odeurs puisse accroître la suspicion d’ICD, elle est rapidement détectée. Dans certains cas, l’imagerie radiologique ou la présence d’une leucocytose rapide en l’absence de signes d’infection sur d’autres sites peut être utile pour distinguer l’ICD des autres causes de diarrhée Identification rapide de l’ICD est nécessaire pour un traitement approprié et rapide pour prévenir la progression de la maladie et pour les interventions de contrôle des infections en temps opportun pour réduire l’incidence des cas nosocomiaux supplémentaires Selon les récentes directives de la Société américaine des maladies infectieuses, les critères diagnostiques CDI sont les suivants: diarrhée défini comme le passage de ≥ selles non formées dans ≤ consecut cinq heures et un résultat de test de selles positif pour la présence de C difficile toxigène ou de ses toxines; Coloscopie microbiologique ou endoscopique avec ou sans examen histologique des biopsies tissulaires peut être utilisé pour répondre aux critères de diagnostic suggérés pour CDI Bien que les données définissant les caractéristiques de performance de l’endoscopie sont limitées, on estime que Les patients présentant des signes macroscopiques ou microscopiques de colite pseudomembraneuse ont également des signes microbiologiques d’ICD L’endoscopie présentant un risque inhérent aux patients, coûteuse et non uniformément disponible, elle doit être utilisée avec parcimonie pour le diagnostic d’ICD L’American College of Gastroeneterology recommande l’endoscopie pour le diagnostic d’ICD lorsqu’un diagnostic rapide est requis et que les tests de laboratoire peuvent être retardés, un échantillon de selles n’est pas disponible chez un patient atteint d’iléus, ou d’autres maladies coliques diagnostiquées par endoscopie sont envisagées . dans le laboratoire de microbiologie oratoire pour la détection de CDI Certains d’entre eux ciblent l’organisme lui-même, comme la culture ou le dosage de l’antigène glutamate déshydrogénase GDH; d’autres détectent la présence de toxines de C difficile dans les selles, telles que le test de neutralisation de cytotoxicité CCNA et les tests immuno-enzymatiques EIA; tandis que d’autres détectent la présence des méthodes moléculaires des gènes de la toxine Parce que le C difficile est un composant normal de la flore intestinale chez les nouveau-nés et colonise asymptomatiquement les adultes, le test microbiologique est seulement recommandé pour les patients & gt; ans présentant des symptômes compatibles avec l’ICD et ayant des antécédents récents d’utilisation d’antibiotiques Une description détaillée de ces méthodes suit, et un résumé des attributs relatifs de chacune de ces méthodes est présenté au tableau.

Tableau Avantages et inconvénients des dosages de Clostridium difficile Dosage Méthode / cible Avantages Inconvénients Culture Organisme Haute sensibilité souvent considérée comme l’étalon-or Temps de rotation & gt; Journées intensives Manque de spécificité; ne distingue pas entre les souches toxigènes et non toxigènes Les isolats doivent être testés pour la présence de toxines ou de gènes de toxines. Culture toxigène Test de neutralisation de la cytotoxicité cellulaire Essai fonctionnel de la toxine C difficile B TcdB Sensibilité modérée à élevée Spécificité élevée – h Temps de traitement interprétation; Requiert des techniciens compétents / expertise technique Laboratoire intensif Essais immunologiques enzymatiques EIA, C difficiletoxine A TcdA Toxine A Détection Facile à réaliser Temps de réponse rapideIndispensable Haute spécificité Faible sensibilité Absence d’isolats TcdA- / TcdB EIA, TcdB ou TcdA / B Toxine A / Bdétection Exécution rapide Temps peu coûteux Haute spécificité Sensibilité plus faible EIA, glutamate déshydrogénase Détection d’antigène commun Haute sensibilité Bon test de dépistage Faible spécificité et ne fait pas la distinction entre souches toxigènes et non-toxigènes Les échantillons positifs doivent être testés pour la présence de toxines ou de gènes de toxine. tests d’amplification Détection des gènes de toxine Haute sensibilité et spécificité nouvelle norme d’or Temps d’exécution court Temps d’exécution facile et minimal Coûteux pour tester tous les échantillons Détection de la colonisation asymptomatique possible Certains nécessitent une expertise moléculaire importante Méthode de dosage / cible Avantages Disa Dvantages Culture Organisme Haute sensibilité souvent considérée comme l’étalon-or Temps de rotation & gt; Journées intensives Manque de spécificité; ne distingue pas entre les souches toxigènes et non toxigènes Les isolats doivent être testés pour la présence de toxines ou de gènes de toxines. Culture toxigène Test de neutralisation de la cytotoxicité cellulaire Essai fonctionnel de la toxine C difficile B TcdB Sensibilité modérée à élevée Spécificité élevée – h Temps de traitement interprétation; Requiert des techniciens compétents / expertise technique Laboratoire intensif Essais immunologiques enzymatiques EIA, C difficiletoxine A TcdA Toxine A Détection Facile à réaliser Temps de réponse rapideIndispensable Haute spécificité Faible sensibilité Absence d’isolats TcdA- / TcdB EIA, TcdB ou TcdA / B Toxine A / Bdétection Exécution rapide Temps peu coûteux Haute spécificité Sensibilité plus faible EIA, glutamate déshydrogénase Détection d’antigène commun Haute sensibilité Bon test de dépistage Faible spécificité et ne fait pas la distinction entre souches toxigènes et non-toxigènes Les échantillons positifs doivent être testés pour la présence de toxines ou de gènes de toxine. tests d’amplification Détection des gènes de toxine Haute sensibilité et spécificité nouveau gold standard Temps d’exécution court Temps d’exécution facile et minimal Coûteux pour tester tous les échantillons Détection de la colonisation asymptomatique: une préoccupation possible Certains nécessitent une expertise moléculaire significative View Large

Culture toxigène

Les méthodes de culture pour augmenter la récupération du C difficile à partir d’échantillons de selles comprennent des techniques de prétraitement par choc thermique ou alcoolique et des étapes d’enrichissement en bouillon liquide En raison de la sélectivité imparfaite des milieux disponibles et du fait que le C difficile toxigène et non toxique, ie non pathogène, peut être isolé des selles, tous les isolements suspects doivent être repiqués et un test de confirmation doit être effectué pour détecter la présence de gènes de toxines ou l’expression des protéines toxines. Cette approche prend beaucoup de temps et de temps, avec des délais d’exécution proches de la semaine. Ainsi, la culture de selles de C difficile est largement utilisée dans un cadre de recherche, même si elle présente des avantages de performance par rapport à de nombreux tests plus rapides

CCNA

Un test de cytotoxicité cellulaire directe qui repose sur la neutralisation de la toxine B C difficile en utilisant une antitoxine pour améliorer la spécificité a été développé peu après la découverte de C difficile. Cette méthode détecte la toxine au picogramme dans les échantillons de selles. Échantillon de selles dilué, tamponné et filtré sur une monocouche de cellules cultivées Si la toxine B C difficile est présente, il a un effet cytopathique caractérisé par l’arrondissement des cellules en culture tissulaire. Ce test est considéré comme ayant des résultats positifs si les changements caractéristiques sont ≥ % des cellules à h et l’effet est inhibé par l’antitoxine C difficile L’interprétation des résultats de ce test est nécessairement subjective et nécessite un lecteur expérimenté CCNA a toujours été utilisé comme étalon-or avec lequel d’autres dosages sont comparés, en particulier les EIA à toxines. sa sensibilité peut être aussi faible que% par rapport aux résultats obtenus par les techniques de culture de selles Une autre limitation majeure de CCNA est que le temps de rotation, en particulier pour les résultats négatifs, est inacceptable jusqu’à h à partir de la réception de l’échantillon dans le laboratoire

EIE

Des EIA conçues pour détecter la TcdA du C difficile ont d’abord été élaborées & gt; il y a des années Depuis lors, les tests qui détectent TcdA, TcdB, l’antigène bactérien GDH, ou une combinaison de certaines ou de toutes ces cibles sont devenues l’approche diagnostique la plus largement utilisée pour les CDI dans les laboratoires américains de microbiologie clinique. culture toxigène, ces tests offrent un temps de réponse rapide, sont moins laborieux et peuvent être effectués par des technologues qui manquent de formation avancée en techniques de culture cellulaire. Malheureusement, il est apparu plus récemment que ces tests, en particulier ceux conçus pour détecter les toxines, manquent de Les EIA qui détectent la GDH présentent une meilleure sensibilité mais sont moins spécifiques, car la GDH est exprimée à la fois par des isolats toxigènes et non toxiques de C difficile, ainsi que par des tests étroitement apparentés sur les espèces de Clostridium qui détectent des combinaisons de ces cibles GDH plus TcdA et / ou TcdB démontrent généralement une meilleure performance globale

Méthodes moléculaires

Essais d’amplification des acides nucléiques Les TAAN pour le C difficile ont d’abord été développés & gt; il y a quelques années, mais l’intérêt clinique et épidémiologique des CDI est devenu plus important , les TAAN utilisant à la fois la réaction en chaîne par polymérase en temps réel et l’amplification isotherme à médiation en boucle des technologies de l’ADN pour la détection de C difficile dans les échantillons de selles ont été approuvés par la Food and Drug Administration des États-Unis et sont adoptés par les laboratoires cliniques Actuellement disponibles kits approuvés par la FDA comprennent le GeneOhm BD, proGastro Prodesse, GeneXpert Céphéide, et Illumigene Meridian C difficile dos Des tests en laboratoire sont également utilisés dans certains établissements, dont la plupart sont basés sur des méthodes PCR et conçus pour détecter le gène tcdB du C difficile. Ces tests prennent généralement plusieurs heures à être réalisés. De nombreuses études ont été publiées, la plupart depuis plusieurs années. les résultats des évaluations contrôlées de la performance des TAAN, comparés à ceux des Méthodes de diagnostic de l’ICD [, -,, -] Dans l’ensemble, il semble que, au moins pour tous les tests approuvés par la FDA, ces tests sont en général beaucoup plus sensibles que les EIA de toxines ~% vs% -% En outre, une étude récente a démontré une sensibilité équivalente des TAAN et de la détection de l’antigène GDH, tandis qu’une autre étude a révélé qu’un TAAN était supérieur à la détection de l’antigène GDH La variabilité entre les études comparant la détection Les TAAN peuvent être le résultat de différences dans la prévalence du génotype. Tenover et al ont montré que la performance des méthodes basées sur l’antigène fluctue de manière génotypique, alors que les TAAN inclus dans leur étude ne présentent pas la même variabilité. préciser si toutes les approches moléculaires sont égales, mais au moins étudier des performances équivalentes documentées pour les essais disponibles dans le commerce et une méthode développée en laboratoire Performance impressionnante Les résultats sont rapides avec l’utilisation de NAAT pour la détection du C difficile, ce qui conduit certains auteurs à conclure que les approches moléculaires représentent la meilleure option évidente pour le dépistage du C difficile. Cependant, les tests moléculaires du C difficile ne sont pas une panacée complète. les méthodes détectent les gènes associés au C difficile toxigène dans les selles, tandis que les CCNA et EIA traditionnels détectent la présence de toxines du C difficile dans les selles Considérant que jusqu’à un pourcentage d’individus institutionnalisés peuvent être asymptomatiquement colonisés par le C difficile toxinogène et que la diarrhée peut Comme il est probable que la colonisation asymptomatique par le C difficile toxinogène protège les patients contre l’ICD, une thérapie inappropriée dans ces circonstances peut exposer le patient à CDI à une date ultérieure En outre, une proportion significative de patients ayant La détection du C difficile dans les selles à l’aide de TAAN après un traitement pour une infection confirmée en laboratoire n’est pas utile. Il est clair que, au moins, les cliniciens doivent être très réceptifs. Un inconvénient final des tests moléculaires pour le CDI est le coût. Les tests TAAT approuvés par la FDA peuvent coûter plus cher qu’un EIA ou un CCNA ou les deux ensemble, alors que les méthodes développées en laboratoire sont plus abordables. des choix difficiles pour équilibrer les performances et les coûts des tests; sans un grand nombre de données démontrant les économies associées aux tests moléculaires de l’ICD, il sera difficile de justifier la mise en œuvre d’un tel test dans de nombreux centres. Il existe des données limitées montrant l’identification rapide des patients infectés par un dosage précis de C difficile. un délai d’exécution rapide peut entraîner des économies en influant sur la gestion des patients et en améliorant les pratiques de contrôle des infections

Méthodes de combinaison et algorithmes

La combinaison de plusieurs technologies de test utilisant des dosages avec des forces et des faiblesses complémentaires a été efficacement utilisée dans plusieurs approches diagnostiques de maladies infectieuses. Plusieurs laboratoires ont utilisé des algorithmes EIA, CCNA et / ou des méthodes moléculaires pour détecter le C difficile toxigène. Beaucoup de ces algorithmes utilisent une première étape qui repose sur le test GDH rapide, sensible et peu coûteux suivi d’une seconde étape qui assure la spécificité d’une seconde méthode EIA, CCNA ou moléculaire [,,] La performance de ces approches a été largement évaluée et , en fonction des tests spécifiques utilisés, atteint des sensibilités de% -%, comparé aux méthodes moléculaires ou culture toxigène, et a une excellente spécificité [,,,,,,, -] Le temps de réponse négatif pour la GDH les spécimens, qui représentent% -% des spécimens dans la plupart des études utilisant de tels algorithmes, sont très rapides, de quelques heures à quelques heures après réception, depe Les résultats positifs et les résultats négatifs au GDH positif ou au second test peuvent ne pas prendre plus de temps avec la toxine EIA concurrente comme deuxième test ou jusqu’à h CCNA comme second test.

Figure Vue largeDownload slideAlgorithme de diagnostic typique pour la détection de Clostridium difficile toxigène dans les échantillons de selles Des immunodosages rapides et peu coûteux qui détectent la glutamate déshydrogénase GDH et peuvent également inclure la détection de toxines; Les étapes sont suivies par des approches plus laborieuses et / ou plus coûteuses qui démontrent souvent de meilleures caractéristiques de performance. Etape Spécimens avec des résultats négatifs dans la première étape qui représentent souvent plus de% des spécimens et ceux qui sont positifs à la GDH ainsi que la toxine C La toxine TcdA et / ou la toxine B C TcdB positive peuvent être signalées après la première étape, ce qui permet à la plupart des laboratoires d’obtenir un délai d’attente très favorable pour la plupart des spécimens. Utilisation d’un test d’amplification de l’acide nucléique NAAT ou test de neutralisation de la cytotoxicité cellulaire CCNA Bien que les TAAN soient souvent plus chers que les CCNA, les performances et le temps d’attente pour les NAAT sont supérieurs à ceux des CCNAFigure View largeTélécharger slideAlgorithme diagnostique typique pour la détection de Clostridium difficile toxigène dans échantillons de selles Des immunodosages rapides et peu coûteux qui détectent la glutamate déshydrogénase GDH et peuvent également détection de toxines ude aussi bien; Les étapes sont suivies par des approches plus laborieuses et / ou plus coûteuses qui démontrent souvent de meilleures caractéristiques de performance. Etape Spécimens avec des résultats négatifs dans la première étape qui représentent souvent plus de% des spécimens et ceux qui sont positifs à la GDH ainsi que la toxine C La toxine TcdA et / ou la toxine B C TcdB positive peuvent être signalées après la première étape, ce qui permet à la plupart des laboratoires d’obtenir un délai d’attente très favorable pour la plupart des spécimens. Bien que les tests NAAT soient souvent plus coûteux que les tests CCNA, la performance et le délai d’exécution des tests NAAT sont supérieurs à ceux des tests CCNA. Une autre approche des tests de C difficile peut être utilisée dans certains laboratoires. algorithmes qui utilisent plusieurs tests effectués en parallèle plutôt que séquentiellement Par exemple, les EIA peuvent être effectuées en même temps qu’un NA AT La performance de ces approches doit encore faire l’objet d’une évaluation approfondie

Répéter les tests

Par exemple, Aichinger et al ont démontré que des tests répétés pour l’ICD dans la journée suivant un résultat négatif obtenu en utilisant un immunodosage ou un TAAN ont été démontrés. Comme aucun test ou algorithme de C difficile n’est% spécifique, un faible pourcentage de résultats faussement positifs devrait être attendu. Lorsque des tests répétés sont effectués pour l’ICD dans une période d’une journée, la probabilité avant le test pour le deuxième dosage est si bas que le rapport des résultats vrais-positifs aux résultats faussement positifs devient très défavorable; cela pourrait entraîner un mauvais diagnostic pour certains patients

IMPLICATIONS POUR LA PRATIQUE CLINIQUE

Dans une étude menée à notre institution Université de médecine et de dentisterie du New Jersey-Robert Wood Johnson Medical School; Le Nouveau-Brunswick, NJ dans, El-Gammal et al ont démontré que les tests de CDI n’avaient pas d’impact significatif sur les décisions thérapeutiques, et le traitement empirique de l’IDC était continué si les résultats de laboratoire étaient positifs ou négatifs. aux résultats des tests de laboratoire pour C difficile en les intégrant à l’image clinique Ceci pourrait résulter de l’incertitude du clinicien concernant les caractéristiques de performance du test, des retards dans la disponibilité des résultats, et / ou une mauvaise communication des résultats. caractéristiques et les limites et les forces des tests disponibles pour le C difficile, il est évident que les méthodes d’essai doivent être connues pour interpréter les résultats. Il est important de considérer que la valeur pratique des valeurs prédictives négatives et positives des tests effectués dépend non seulement sur les tests utilisés, mais aussi sur la valeur seuil de positivité analytique par exemple, dans des dosages approuvés par la FDA, développés en laboratoire ou modifiés, et les compétences techniques de ceux qui réalisent les tests et les variables pré-analytiques telles que les protocoles de manipulation des échantillons et la prévalence spécifique de la maladie. Le médecin n’est pas sûr de la pratique courante du laboratoire En outre, parce que l’importance des résultats positifs dépendra de la probabilité que le patient soit asymptomatiquement colonisé, plutôt que d’être infecté activement par le C difficile, une sélection appropriée des patients à tester et En particulier, seuls les patients répondant aux critères cliniques de l’ICD doivent être testés, et seuls les échantillons de selles non formés doivent être acceptés par le laboratoire pour le test du C difficile. Connaissance des caractéristiques du test et connaissance de la pratique actuelle du laboratoire auquel ils soumettent des spécimens, des médecins peut intégrer avec plus de confiance les résultats des tests avec des données cliniques pour formuler une approche thérapeutique rationnelle Conflits d’intérêts potentiels Tous les auteurs: Aucun conflit signaléTous les auteurs ont soumis le formulaire ICMJE pour la divulgation des conflits potentiels d’intérêts que les éditeurs considèrent pertinents pour le contenu du manuscrit. a été divulguée dans la section Remerciements